當(dāng)病毒感染宿主,病毒的特定組分會被宿主細(xì)胞的特定受體識別,信號再通過一些接頭蛋白和激酶的傳遞,級聯(lián)放大,最終誘導(dǎo)宿主表達(dá)出大量的抗病毒細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子,如干擾素,炎癥因子和趨化因子。天然免疫應(yīng)答對于宿主防御病毒入侵至關(guān)重要。另一方面,為了避免過度的免疫反應(yīng)對機(jī)體造成傷害,浪費細(xì)胞資源,宿主的天然免疫應(yīng)答需要被嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)控。關(guān)于宿主免疫系統(tǒng)的“剎車”機(jī)制,已經(jīng)有不少研究報道了相關(guān)的現(xiàn)象和機(jī)制,同時,還有許多未知有待闡明。本研究鑒定了一個新的負(fù)向調(diào)控抗病毒天然免疫的宿主蛋白,抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白 1(transporter 1,associated with antigen processing),簡稱 TAP1。在不同的細(xì)胞系(A549,THP-l,HeLa)中用不同的病毒(IAV,VSV,SeV)測試,發(fā)現(xiàn)病毒感染能在轉(zhuǎn)錄水平顯著誘導(dǎo)TAP1的表達(dá)。由于已有文章報道TAP1是干擾素誘導(dǎo)基因(ISG),我們利用siRAN介導(dǎo)的STAT1敲低和I型干擾素缺失的Vero細(xì)胞實驗,發(fā)現(xiàn)病毒感染對TAP1的誘導(dǎo)表達(dá)不依賴于干擾素。進(jìn)一步探究TAP1在病毒感染中是否具有調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示,在細(xì)胞...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點
摘要
Abstract
第一章 天然免疫應(yīng)答
    1.1 天然免疫簡介
    1.2 干擾素
        1.2.1 干擾素的分類和功能
        1.2.2 干擾素基因的轉(zhuǎn)錄
        1.2.3 干擾素受體
        1.2.4 JAK-STAT信號通路
        1.2.5 干擾素誘導(dǎo)基因(ISG)
    1.3 促炎因子和炎癥反應(yīng)
        1.3.1 炎癥反應(yīng)簡介
        1.3.2 病毒誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)
        1.3.3 促炎因子的功能
            1.3.3.1 IL-6
            1.3.3.2 IL-8
            1.3.3.3 IL-1β
            1.3.3.4 TNF-α
    1.4 天然免疫信號通路
        1.4.1 TLRs信號通路
            1.4.1.1 TLRs種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.1.2 TLRs介導(dǎo)的天然免疫信號途徑
        1.4.2 RLRs信號通路
            1.4.2.1 RLRs的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.2.2 RLRs介導(dǎo)的天然免疫信號途徑
        1.4.3 NLRs信號通路
            1.4.3.1 NLRs的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.3.2 NLRs介導(dǎo)的天然免疫信號途徑
        1.4.4 胞質(zhì)DNA受體信號通路
            1.4.4.1 胞質(zhì)DNA受體的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.4.2 胞質(zhì)DNA受體介導(dǎo)的天然免疫信號途徑
    1.5 TAK1復(fù)合物在天然免疫信號通路中的作用
第二章 抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白1(TAP1)
    2.1 TAP1基因的發(fā)現(xiàn)
    2.2 TAP1的肽段轉(zhuǎn)運功能
    2.3 TAP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
    2.4 TAP1的表達(dá)調(diào)控
    2.5 TAP1與病毒
第三章 病毒
    3.1 流感病毒
    3.2 仙臺病毒
    3.3 水泡性口炎病毒
    3.4 腸道病毒71型
第四章 病毒感染誘導(dǎo)TAP1表達(dá)
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細(xì)胞及病毒
        4.1.2 質(zhì)粒
        4.1.3 試劑
        4.1.4 儀器和耗材
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            4.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            4.2.1.2 細(xì)胞傳代
            4.2.1.3 細(xì)胞凍存
            4.2.1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和抽提
            4.2.3.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
            4.2.3.2 YC法轉(zhuǎn)化
            4.2.3.3 質(zhì)粒抽提
        4.2.4 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
            4.2.4.1 細(xì)胞總RNA提取
            4.2.4.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
        4.2.5 實時熒光定量PCR
        4.2.6 蛋白質(zhì)免疫印記
        4.2.7 熒光素酶報告實驗
        4.2.8 IAV和SeV的擴(kuò)增和效價測定
            4.2.8.1 病毒擴(kuò)增
            4.2.8.2 效價測定
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 病毒感染誘導(dǎo)TAP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高
        4.3.2 病毒感染激活TAP1啟動子活性
        4.3.3 病毒對TAP1表達(dá)的誘導(dǎo)不依賴于干擾素
    4.4 討論
第五章 TAP1促進(jìn)病毒復(fù)制
    5.1 實驗材料
        5.1.1 細(xì)胞及病毒
        5.1.2 質(zhì)粒
        5.1.3 試劑
        5.1.4 儀器及耗材
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            5.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.2.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        5.2.2 流感病毒復(fù)制測定
        5.2.3 VSV空斑實驗
        5.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測VSV-eGFP復(fù)制效率
        5.2.5 TAP1穩(wěn)定敲減A549細(xì)胞系的構(gòu)建
            5.2.5.1 pLKO.1-shTAP1質(zhì)粒構(gòu)建
            5.2.5.2 慢病毒的包裝、感染和目標(biāo)細(xì)胞系的篩選
        5.2.6 細(xì)胞計數(shù)
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 過表達(dá)TAP1能促進(jìn)病毒復(fù)制
        5.3.2 敲低TAP1表達(dá)能削弱病毒復(fù)制
        5.3.3 TAP1對病毒復(fù)制的影響與干擾素應(yīng)答相關(guān)
    5.4 討論
第六章 TAP1負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
    6.1 實驗材料
        6.1.1 細(xì)胞及病毒
        6.1.2 質(zhì)粒
        6.1.3 試劑
    6.2 實驗方法
        6.2.1 熒光素酶報告實驗
        6.2.2 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
        6.2.3 實時熒光定量PCR
        6.2.4 半定量PCR
        6.2.5 蛋白質(zhì)免疫印記
        6.2.6 TAP1穩(wěn)定敲減THP-1細(xì)胞系構(gòu)建
    6.3 實驗結(jié)果
        6.3.1 過表達(dá)TAP1能負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
            6.3.1.1 過表達(dá)TAP1對干擾素啟動子活性的影響
            6.3.1.2 過表達(dá)TAP1對內(nèi)源性干擾素表達(dá)的影響
            6.3.1.3 過表達(dá)TAP1對干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)的影響
        6.3.2 敲低TAP1能正調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
            6.3.2.1 敲低TAP1對干擾素啟動子活性的影響
            6.3.2.2 敲低TAP1對內(nèi)源性干擾素表達(dá)的影響
            6.3.2.3 敲低TAP1對干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)的影響
    6.4 討論
第七章 TAP1負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)
    7.1 實驗材料
        7.1.1 細(xì)胞與病毒
        7.1.2 質(zhì)粒
    7.2 實驗方法
        7.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        7.2.2 熒光素酶報告實驗
        7.2.3 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
        7.2.4 實時熒光定量PCR
        7.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡
    7.3 實驗結(jié)果
        7.3.1 過表達(dá)TAP1對病毒誘導(dǎo)的IL-6,IL-8啟動子的影響
        7.3.2 過表達(dá)TAP1對病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源性促炎因子表達(dá)的影響
        7.3.3 敲低TAP1對病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源性促炎因子表達(dá)的影響
    7.4 討論
第八章 TAP1通過靶向TAK1復(fù)合物調(diào)控免疫應(yīng)答
    8.1 實驗材料
        8.1.1 細(xì)胞與病毒
        8.1.2 質(zhì)粒
        8.1.3 試劑
        8.1.4 儀器及耗材
    8.2 實驗方法
        8.2.1 熒光素酶報告實驗
        8.2.2 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)
        8.2.3 亞細(xì)胞組分分離
        8.2.4 免疫熒光實驗
    8.3 實驗結(jié)果
        8.3.1 TAP1通過TAK1復(fù)合物調(diào)控病毒誘導(dǎo)的信號通路
        8.3.2 外源表達(dá)的TAP1與TAK1復(fù)合物相互作用
        8.3.3 內(nèi)源性的TAP1與TAK1相互作用
        8.3.4 病毒感染對TAP1亞細(xì)胞定位的影響
    8.4 討論
第九章 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的TAK1磷酸化及其下游信號通路
    9.1 實驗材料
        9.1.1 細(xì)胞及病毒
        9.1.2 質(zhì)粒
        9.1.3 試劑
    9.2 實驗方法
        9.2.1 蛋白質(zhì)免疫印跡
        9.2.2 核質(zhì)分離實驗
        9.2.3 免疫熒光實驗
    9.3 實驗結(jié)果
        9.3.1 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的TAK1磷酸化
        9.3.2 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的IKK,IκBα和p38 MAPK的磷酸化
        9.3.3 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的NF-κB入核
    9.4 討論
第十章 研究總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
博士在讀期間已發(fā)表和待發(fā)表的文章
附錄 常用試劑配制
致謝



本文編號：4019004