當(dāng)病毒感染宿主,病毒的特定組分會(huì)被宿主細(xì)胞的特定受體識(shí)別,信號(hào)再通過一些接頭蛋白和激酶的傳遞,級(jí)聯(lián)放大,最終誘導(dǎo)宿主表達(dá)出大量的抗病毒細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子,如干擾素,炎癥因子和趨化因子。天然免疫應(yīng)答對(duì)于宿主防御病毒入侵至關(guān)重要。另一方面,為了避免過度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成傷害,浪費(fèi)細(xì)胞資源,宿主的天然免疫應(yīng)答需要被嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)控。關(guān)于宿主免疫系統(tǒng)的“剎車”機(jī)制,已經(jīng)有不少研究報(bào)道了相關(guān)的現(xiàn)象和機(jī)制,同時(shí),還有許多未知有待闡明。本研究鑒定了一個(gè)新的負(fù)向調(diào)控抗病毒天然免疫的宿主蛋白,抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1(transporter 1,associated with antigen processing),簡(jiǎn)稱 TAP1。在不同的細(xì)胞系(A549,THP-l,HeLa)中用不同的病毒(IAV,VSV,SeV)測(cè)試,發(fā)現(xiàn)病毒感染能在轉(zhuǎn)錄水平顯著誘導(dǎo)TAP1的表達(dá)。由于已有文章報(bào)道TAP1是干擾素誘導(dǎo)基因(ISG),我們利用siRAN介導(dǎo)的STAT1敲低和I型干擾素缺失的Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)病毒感染對(duì)TAP1的誘導(dǎo)表達(dá)不依賴于干擾素。進(jìn)一步探究TAP1在病毒感染中是否具有調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示,在細(xì)胞...

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
Abstract
第一章 天然免疫應(yīng)答
    1.1 天然免疫簡(jiǎn)介
    1.2 干擾素
        1.2.1 干擾素的分類和功能
        1.2.2 干擾素基因的轉(zhuǎn)錄
        1.2.3 干擾素受體
        1.2.4 JAK-STAT信號(hào)通路
        1.2.5 干擾素誘導(dǎo)基因(ISG)
    1.3 促炎因子和炎癥反應(yīng)
        1.3.1 炎癥反應(yīng)簡(jiǎn)介
        1.3.2 病毒誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)
        1.3.3 促炎因子的功能
            1.3.3.1 IL-6
            1.3.3.2 IL-8
            1.3.3.3 IL-1β
            1.3.3.4 TNF-α
    1.4 天然免疫信號(hào)通路
        1.4.1 TLRs信號(hào)通路
            1.4.1.1 TLRs種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.1.2 TLRs介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)途徑
        1.4.2 RLRs信號(hào)通路
            1.4.2.1 RLRs的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.2.2 RLRs介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)途徑
        1.4.3 NLRs信號(hào)通路
            1.4.3.1 NLRs的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.3.2 NLRs介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)途徑
        1.4.4 胞質(zhì)DNA受體信號(hào)通路
            1.4.4.1 胞質(zhì)DNA受體的種類和結(jié)構(gòu)
            1.4.4.2 胞質(zhì)DNA受體介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)途徑
    1.5 TAK1復(fù)合物在天然免疫信號(hào)通路中的作用
第二章 抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(TAP1)
    2.1 TAP1基因的發(fā)現(xiàn)
    2.2 TAP1的肽段轉(zhuǎn)運(yùn)功能
    2.3 TAP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
    2.4 TAP1的表達(dá)調(diào)控
    2.5 TAP1與病毒
第三章 病毒
    3.1 流感病毒
    3.2 仙臺(tái)病毒
    3.3 水泡性口炎病毒
    3.4 腸道病毒71型
第四章 病毒感染誘導(dǎo)TAP1表達(dá)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞及病毒
        4.1.2 質(zhì)粒
        4.1.3 試劑
        4.1.4 儀器和耗材
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            4.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            4.2.1.2 細(xì)胞傳代
            4.2.1.3 細(xì)胞凍存
            4.2.1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和抽提
            4.2.3.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
            4.2.3.2 YC法轉(zhuǎn)化
            4.2.3.3 質(zhì)粒抽提
        4.2.4 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
            4.2.4.1 細(xì)胞總RNA提取
            4.2.4.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
        4.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.2.6 蛋白質(zhì)免疫印記
        4.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        4.2.8 IAV和SeV的擴(kuò)增和效價(jià)測(cè)定
            4.2.8.1 病毒擴(kuò)增
            4.2.8.2 效價(jià)測(cè)定
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 病毒感染誘導(dǎo)TAP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高
        4.3.2 病毒感染激活TAP1啟動(dòng)子活性
        4.3.3 病毒對(duì)TAP1表達(dá)的誘導(dǎo)不依賴于干擾素
    4.4 討論
第五章 TAP1促進(jìn)病毒復(fù)制
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 細(xì)胞及病毒
        5.1.2 質(zhì)粒
        5.1.3 試劑
        5.1.4 儀器及耗材
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            5.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.2.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        5.2.2 流感病毒復(fù)制測(cè)定
        5.2.3 VSV空斑實(shí)驗(yàn)
        5.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSV-eGFP復(fù)制效率
        5.2.5 TAP1穩(wěn)定敲減A549細(xì)胞系的構(gòu)建
            5.2.5.1 pLKO.1-shTAP1質(zhì)粒構(gòu)建
            5.2.5.2 慢病毒的包裝、感染和目標(biāo)細(xì)胞系的篩選
        5.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 過表達(dá)TAP1能促進(jìn)病毒復(fù)制
        5.3.2 敲低TAP1表達(dá)能削弱病毒復(fù)制
        5.3.3 TAP1對(duì)病毒復(fù)制的影響與干擾素應(yīng)答相關(guān)
    5.4 討論
第六章 TAP1負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 細(xì)胞及病毒
        6.1.2 質(zhì)粒
        6.1.3 試劑
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        6.2.2 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
        6.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        6.2.4 半定量PCR
        6.2.5 蛋白質(zhì)免疫印記
        6.2.6 TAP1穩(wěn)定敲減THP-1細(xì)胞系構(gòu)建
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3.1 過表達(dá)TAP1能負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
            6.3.1.1 過表達(dá)TAP1對(duì)干擾素啟動(dòng)子活性的影響
            6.3.1.2 過表達(dá)TAP1對(duì)內(nèi)源性干擾素表達(dá)的影響
            6.3.1.3 過表達(dá)TAP1對(duì)干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)的影響
        6.3.2 敲低TAP1能正調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素應(yīng)答
            6.3.2.1 敲低TAP1對(duì)干擾素啟動(dòng)子活性的影響
            6.3.2.2 敲低TAP1對(duì)內(nèi)源性干擾素表達(dá)的影響
            6.3.2.3 敲低TAP1對(duì)干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)的影響
    6.4 討論
第七章 TAP1負(fù)調(diào)控病毒誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)
    7.1 實(shí)驗(yàn)材料
        7.1.1 細(xì)胞與病毒
        7.1.2 質(zhì)粒
    7.2 實(shí)驗(yàn)方法
        7.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        7.2.2 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        7.2.3 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
        7.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        7.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡
    7.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        7.3.1 過表達(dá)TAP1對(duì)病毒誘導(dǎo)的IL-6,IL-8啟動(dòng)子的影響
        7.3.2 過表達(dá)TAP1對(duì)病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源性促炎因子表達(dá)的影響
        7.3.3 敲低TAP1對(duì)病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源性促炎因子表達(dá)的影響
    7.4 討論
第八章 TAP1通過靶向TAK1復(fù)合物調(diào)控免疫應(yīng)答
    8.1 實(shí)驗(yàn)材料
        8.1.1 細(xì)胞與病毒
        8.1.2 質(zhì)粒
        8.1.3 試劑
        8.1.4 儀器及耗材
    8.2 實(shí)驗(yàn)方法
        8.2.1 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        8.2.2 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)
        8.2.3 亞細(xì)胞組分分離
        8.2.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    8.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        8.3.1 TAP1通過TAK1復(fù)合物調(diào)控病毒誘導(dǎo)的信號(hào)通路
        8.3.2 外源表達(dá)的TAP1與TAK1復(fù)合物相互作用
        8.3.3 內(nèi)源性的TAP1與TAK1相互作用
        8.3.4 病毒感染對(duì)TAP1亞細(xì)胞定位的影響
    8.4 討論
第九章 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的TAK1磷酸化及其下游信號(hào)通路
    9.1 實(shí)驗(yàn)材料
        9.1.1 細(xì)胞及病毒
        9.1.2 質(zhì)粒
        9.1.3 試劑
    9.2 實(shí)驗(yàn)方法
        9.2.1 蛋白質(zhì)免疫印跡
        9.2.2 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)
        9.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    9.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        9.3.1 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的TAK1磷酸化
        9.3.2 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的IKK,IκBα和p38 MAPK的磷酸化
        9.3.3 TAP1抑制病毒誘導(dǎo)的NF-κB入核
    9.4 討論
第十章 研究總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
博士在讀期間已發(fā)表和待發(fā)表的文章
附錄 常用試劑配制
致謝



本文編號(hào)：4019004