目的:通過克隆表達(dá)細(xì)粒棘球蚴微管蛋白,并進(jìn)行藥物相關(guān)作用研究,尋找在細(xì)粒棘球蚴的生命過程起重要作用、并可作為藥物靶點的微管蛋白同型。方法:采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)對細(xì)粒棘球蚴微管蛋白同型的表達(dá)水平進(jìn)行分析;采用原核表達(dá)系統(tǒng)及鎳柱親和層析法表達(dá)、純化細(xì)粒棘球蚴微管蛋白 Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-α9(EgTUA9)兩個同型,并利用 SDS-PAGE進(jìn)行鑒定;用濁度法檢測微管蛋白溶液吸光值的變化以分析重組微管蛋白rEgTUB4和rEgTUA9的聚合效果并用透射電鏡觀察聚合產(chǎn)物的超微結(jié)構(gòu);將苯并咪唑類藥物同重組微管蛋白共孵育,觀察其對微管蛋白聚合反應(yīng)的影響,同時用RT-PCR和Western blot法評價上述藥物對細(xì)粒棘球蚴微管蛋白同型基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:細(xì)粒棘球蚴的多種微管蛋白同型的表達(dá)水平各不相同,其中Tubulin-α5、Tubulin-α9、Tubulin-β2(EgTUB2)、Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-β6(EgTUB6)等5個同型在原頭節(jié)和囊壁組織中的表達(dá)水平均較高。原核表達(dá)得到rEgTUB4...

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常用縮寫詞中英文對照表
前言
    1 棘球蚴病的流行現(xiàn)狀
        1.1 細(xì)粒棘球蚴病
        1.2 多房棘球蚴病
        1.3 其他棘球蚴病
    2 棘球蚴病的治療措施
    3 棘球蚴病治療藥物的研究手段概述
    4 微管和微管蛋白
        4.1 微管的結(jié)構(gòu)特點
        4.2 微管的動力學(xué)特征及生物學(xué)功能
        4.3 寄生蟲微管的研究現(xiàn)狀
        4.4 微管蛋白體外聚合反應(yīng)的研究現(xiàn)狀
        4.5 微管蛋白抑制劑
    5 苯并咪唑類藥物的抗寄生蟲作用
    6 研究目的和意義
    7 研究目標(biāo)與內(nèi)容
        7.1 研究目標(biāo)
        7.2 研究內(nèi)容
第一部分 細(xì)粒棘球蚴微管蛋白的表達(dá)水平分析
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和囊壁組織
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 基因組的搜索與引物設(shè)計
        2.2 總RNA的提取
        2.3 cDNA的合成
        2.4 細(xì)粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β同型基因的表達(dá)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 總RNA的質(zhì)量鑒定
        3.2 細(xì)粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β基因mRNA的表達(dá)量
            3.2.1 細(xì)粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β的擴增曲線及熔解曲線
            3.2.2 細(xì)粒棘球蚴各同型微管蛋白的相對表達(dá)量
    4 討論
第二部分 細(xì)粒棘球蚴微管蛋白的原核表達(dá)及純化
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 原頭節(jié)cDNA
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 引物設(shè)計與合成
        2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.1 目標(biāo)基因的擴增
            2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳及切膠
            2.2.3 目標(biāo)片段的膠回收
            2.2.4 TA-克隆
            2.2.5 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            2.2.6 質(zhì)粒抽提
            2.2.7 酶切及酶連
        2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
        2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.5 重組蛋白的大量表達(dá)及可溶性蛋白的純化
        2.6 重組蛋白的Western Blot驗證
    3 結(jié)果與分析
        3.1 目標(biāo)基因的擴增
        3.2 菌落PCR驗證
        3.3 雙酶切鑒定
        3.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
        3.5 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.6 重組蛋白的純化
        3.7 重組蛋白的特異性鑒定
    4 討論
第三部分 細(xì)粒棘球蚴重組微管蛋白的體外聚合及苯并咪唑類藥物的影響
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 原頭節(jié)
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 重組微管蛋白的體外聚合
            2.1.1 聚合產(chǎn)物的激光共聚焦觀察
            2.1.2 聚合產(chǎn)物的透射電鏡觀察
        2.2 苯并咪唑類藥物對重組微管蛋白體外聚合的影響
        2.3 苯并咪唑類藥物對豬腦微管蛋白體外聚合的影響
        2.4 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響
    3 結(jié)果與分析
        3.1 重組微管蛋白體外聚合濃度的優(yōu)化
            3.1.1 聚合產(chǎn)物的激光共聚焦觀察
            3.1.2 聚合產(chǎn)物的透射電鏡觀察
        3.2 苯并咪唑類藥物對重組微管蛋白體外聚合的影響
        3.3 苯并咪唑類藥物對豬腦微管蛋白體外聚合的影響
        3.4 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)微管蛋白基因mRNA表達(dá)量的影響
        3.5 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)微管蛋白基因蛋白表達(dá)的影響
    4 討論
結(jié)論和展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
論著
發(fā)表文章
致謝



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