人胃內(nèi)因子(GIF)在人體內(nèi)具有重要的作用,主要協(xié)助VB12在小腸中的吸收,缺失將導(dǎo)致機(jī)體惡性貧血,同時會降低免疫力。谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)作為一種不產(chǎn)內(nèi)毒素的食品級安全微生物,在藥用蛋白的表達(dá)上具有巨大的優(yōu)勢。為了在C.glutamicum中進(jìn)行藥用蛋白GIF的表達(dá),編碼GIF的重組基因rgif被合成,且進(jìn)行密碼子優(yōu)化以保證GIF的正常翻譯。重組基因rgif成功克隆到表達(dá)載體pXMJ19上,并導(dǎo)入C.glutamicum成功進(jìn)行GIF的表達(dá)。為了提高GIF的表達(dá)效果,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對GIF的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)GIF在C.glutamicum中的最佳發(fā)酵條件組合為:IPTG濃度100μmol/L、誘導(dǎo)時機(jī)10 h、發(fā)酵時長22 h、發(fā)酵溫度23℃,在該條件下GIF得到可溶性表達(dá),且可以通過His標(biāo)簽被HisTrap FF柱純化。在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)的GIF可以通過ELISA試劑盒檢測到免疫活性,且定量產(chǎn)量達(dá)到42.3 mg/L。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),GIF的產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度從23℃增加到37℃持續(xù)降低,隨著誘導(dǎo)時機(jī)從0 h延遲到10 h持續(xù)增加,隨著發(fā)酵時...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株與質(zhì)粒
        1.1.2 主要試劑與儀器
        1.1.3 培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 基因合成
        1.2.2 表達(dá)載體pXMJ19-rgif的構(gòu)建
        1.2.3 C.glutamicum/pXMJ19-rgif的構(gòu)建
        1.2.4 C.glutamicum/pXMJ19-rgif和C.glutamicum/pXMJ19的誘導(dǎo)表達(dá)
        1.2.5 C.glutamicum/pXMJ19-rgif的發(fā)酵條件優(yōu)化
        1.2.6 WB結(jié)果灰度分析
        1.2.7 GIF蛋白純化及定量
        1.2.8 GIF活性分析
2 結(jié)果
    2.1 pXMJ19-rgif的構(gòu)建
    2.2 表達(dá)菌株C.glutamicum/pXMJ19-rgif的構(gòu)建
    2.3 C.glutamicum/pXMJ19-rgif和C.glutamicum/pXMJ19的誘導(dǎo)表達(dá)
    2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化C.glutamicum/pXMJ19-rgif發(fā)酵產(chǎn)GIF
    2.5 GIF發(fā)酵表達(dá)及純化定量
    2.6 GIF活性分析
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