糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中主要的修飾方式之一。研究表明,細(xì)胞50%以上的蛋白質(zhì)存在糖基化修飾。蛋白質(zhì)糖基化在蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、受體活化、分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)吞作用、分子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞排斥、細(xì)胞黏附等眾多生物過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)糖基化分為N-糖基化、O-糖基化和GPI錨定糖基化。其中O-糖基化發(fā)生在蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基氧原子上。O-連接氮乙酰半乳糖胺修飾(O-GalNAc)和O-連接氮乙酰葡糖胺修飾(O-GlcNAc)是兩種重要的O-糖基化。O-GalNAc修飾糖基化反應(yīng)由多肽GalNAc轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-Ts)催化起始,在其他特異性糖基轉(zhuǎn)移酶催化下繼續(xù)延伸,生成含有分枝O-連接復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)。O-GlcNAc糖基化則是在O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)催化下,利用UDP-GlcNAc為底物糖供體,將GlcNAc共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的絲/蘇氨酸殘基上的一種動(dòng)態(tài)可逆單糖修飾。這兩種O-糖基化修飾底物分布廣泛,功能各異,參與調(diào)節(jié)了幾乎所有重要生理過(guò)程和重大疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究表明,重要的人源轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白A1(FOXA1)可能發(fā)生...

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 緒論
    1.1 蛋白質(zhì)的糖基化修飾
        1.1.1 O-GalNAc修飾
        1.1.2 O-GlcNAc修飾
        1.1.3 糖基化異常與疾病發(fā)生發(fā)展
    1.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXA1
        1.2.1 FOXA1 概述
        1.2.2 FOXA1 蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2.3 FOXA1 生理功能
        1.2.4 FOXA1 的糖基化修飾
    1.3 本研究的目的和意義
2 體外反應(yīng)體系鑒定人源FOXA1 蛋白的O-GalNAc修飾位點(diǎn)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株、載體
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)溶液
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 原核表達(dá)載體pET28a(+)-FOXA1 質(zhì)粒的提取
        2.3.2 人源FOXA1 蛋白的原核重組表達(dá)
        2.3.3 SDS-PAGE電泳
        2.3.4 考馬斯亮藍(lán)染色分析
        2.3.5 Western Blot分析
        2.3.6 人源FOXA1 蛋白的純化
        2.3.7 293 T細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.8 糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2 的真核重組表達(dá)與純化
        2.3.9 糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2 的酶活鑒定
        2.3.10 ppGalNAc-T2 糖基轉(zhuǎn)移酶催化FOXA1 蛋白的酶活反應(yīng)
        2.3.11 蛋白質(zhì)譜分析
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 人源FOXA1 蛋白的原核重組表達(dá)與純化
        2.4.2 糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2 的真核重組表達(dá)與純化
        2.4.3 糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2 的酶活鑒定
        2.4.4 ppGalNAc-T2 體外催化FOXA1 蛋白發(fā)生O-GalNAc修飾
        2.4.5 蛋白質(zhì)譜鑒定FOXA1 蛋白的O-GalNAc修飾位點(diǎn)
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
3 體外反應(yīng)體系鑒定人源FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修飾位點(diǎn)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 細(xì)胞、菌株和載體
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)溶液
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 設(shè)計(jì)引物
        3.3.2 FOXA1 基因擴(kuò)增
        3.3.3 PCR產(chǎn)物回收
        3.3.4 FOXA1 基因、pMD19-T-Simple載體連接
        3.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.3.6 限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定質(zhì)粒及測(cè)序
        3.3.7 表達(dá)載體pCMVPuro-HA與 pMD19-T-Simple-FOXA1 的雙酶切
        3.3.8 pCMVPuro-HA載體片段與FOXA1 目的基因片段的連接
        3.3.9 pCMVPuro-FOXA1-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞
        3.3.10 真核細(xì)胞中FOXA1 重組蛋白的純化
        3.3.11 糖基轉(zhuǎn)移酶OGT感受態(tài)細(xì)胞制備
        3.3.12 FOXA1 蛋白與OGT糖基轉(zhuǎn)移酶共表達(dá)BL21(DE3)菌株建立
        3.3.13 O-GlcNAc修飾的重組FOXA1 蛋白的原核表達(dá)、純化
        3.3.14 蛋白質(zhì)譜分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 真核表達(dá)體系中重組FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化驗(yàn)證
        3.4.2 O-GlcNAc糖基化原核反應(yīng)體系的構(gòu)建
        3.4.3 O-GlcNAc修飾的重組FOXA1 蛋白的純化
        3.4.4 FOXA1的O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的在線預(yù)測(cè)
        3.4.5 蛋白質(zhì)譜鑒定FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修飾位點(diǎn)
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A pCMVPuro-FOXA1-HA質(zhì)粒圖譜
附錄B FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號(hào)：3792853