目的構(gòu)建白脂素的原核表達質(zhì)粒,表達及純化重組白脂素蛋白,并初步探索其功能,為進一步研究白脂素作用機制及其生理病理作用提供依據(jù)。方法利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達白脂素BL21菌株,經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo),梯度尿素復(fù)性,親和層析純化及去內(nèi)毒素處理得到可用于細胞和動物實驗的重組白脂素。采用血糖儀檢測重組白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖變化情況。Alamar Blue檢測重組白脂素作用24 h對MIHA細胞活性的影響;重組白脂素刺激MIHA細胞24 h,用蒽酮法檢測糖原含量。結(jié)果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)4 h目的蛋白表達效果較好。通過純化和去內(nèi)毒素處理,重組白脂素純度大于95%,內(nèi)毒素含量小于1 EU/mg,可以用于動物與細胞實驗。腹腔注射重組白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重組白脂素組vs對照組P=0.021),120 min恢復(fù)到正常水平(重組白脂素組vs對照組P=0.03)。重組白脂素刺激MIHA細胞24 h,對細胞活性沒有影響;檢測糖原發(fā)現(xiàn),不同濃度白脂素組糖原與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P₁=0.013,...

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒與細胞、動物
        1.1.2 主要試劑與儀器
    1.2 方法
        1.2.1 白脂素表達載體的構(gòu)建
        1.2.2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
        1.2.3 表達條件優(yōu)化
        1.2.4 包涵體變性與復(fù)性、純化
        1.2.5 表達蛋白鑒定與去除內(nèi)毒素
        1.2.6 重組白脂素對C57小鼠血糖的影響
        1.2.7 Alamar Blue法檢測重組白脂素對MIHA細胞活性的影響
        1.2.8 純化的白脂素對MIHA肝細胞糖原的作用
        1.2.9 統(tǒng)計分析
2 結(jié)果
    2.1 p ET-22b-asprosin質(zhì)粒測序、His-Asprosin表達、包涵體復(fù)性及純化條件
    2.2 重組蛋白的驗證
    2.3 腹腔注射重組白脂素對小鼠血糖的影響
    2.4 白脂素對MIHA細胞活性的影響
    2.5 重組白脂素對MIHA細胞糖原代謝的作用
3 討論



本文編號：3770739