免疫檢查點(diǎn)是在人體內(nèi)免疫調(diào)控過程中的可以下調(diào)免疫效應(yīng)細(xì)胞激活反應(yīng)的關(guān)鍵因子,而PD-1正是T細(xì)胞上的重要免疫點(diǎn)之一。腫瘤細(xì)胞通過在其細(xì)胞膜表面高表達(dá)PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合,向吞噬細(xì)胞發(fā)出“Do not eat me”的信號,從而促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的凋亡,減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡,最終實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。阻斷型抗體是通過阻斷PD-1、PD-L1之間的信號傳遞,減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡,從而增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究以獲取PD-1、PD-L1單克隆抗體為目的,通過病毒免疫技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、全合成人源抗體庫篩選技術(shù)等,獲得了可以特異性識別PD-1蛋白的單克隆抗體4G9及PD-L1蛋白的單克隆抗體1A7。首先,通過病毒包裝的方式,產(chǎn)生滴度為1×10⁶TU/mL PD-1慢病毒顆粒。同時(shí)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備濃度為0.54mg/mL,純度>85%的PD-1ECD重組蛋白用于接下來的抗體檢測實(shí)驗(yàn)。利用病毒顆粒感染小鼠,已達(dá)到抗原免疫的效果,其效價(jià)大于1:2.6×10⁷。接著利用細(xì)胞融合技術(shù)獲取7株可以產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞,...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 抗體治療手段的優(yōu)勢及常用技術(shù)
    1.2 免疫檢查點(diǎn)抗體治療手段
    1.3 PD-1、PD-L1 分子
        1.3.1 PD-1、PD-L1 的結(jié)構(gòu)與分布
        1.3.2 PD-1與PD-L1 的作用機(jī)制
        1.3.3 PD-1、PD-L1 與腫瘤治療
        1.3.4 國內(nèi)外研究進(jìn)展
    1.4 本課題內(nèi)容概述
        1.4.1 人源PD-1、PD-L1 胞外區(qū)重組蛋白的制備與鑒定
        1.4.2 抗PD-1 鼠源單抗的篩選及制備
        1.4.3 人源噬菌體抗體庫的篩選及表達(dá)
第二章 人源PD-1、PD-L1 胞外區(qū)重組蛋白的制備與鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 載體與菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        2.1.4 溶液配制
    2.2 方法
        2.2.1 pET28a-PD-1ECD、pET28a-PD-L1ECD重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 PD-1、PD-L1 重組蛋白的原核表達(dá)及鑒定
        2.2.3 PD-1、PD-L1 重組蛋白的原核表達(dá)形式分析
        2.2.4 PD-1、PD-L1 重組蛋白的純化
        2.2.5 PD-1、PD-L1 重組蛋白的抗原性鑒定
        2.2.6 PD-1、PD-L1 重組蛋白的濃度測定
        2.2.7 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒包裝
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 pET28a-PD-1、pET28a-PD-L1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 重組蛋白的原核表達(dá)
        2.3.3 重組蛋白的純化
        2.3.4 重組蛋白的抗原性鑒定
        2.3.5 重組蛋白的濃度測定
        2.3.6 pCDH-CMV-MCS-EF1-EGFP-Puro-PD-1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.7 病毒包裝及滴度測定
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 抗PD-1鼠源單抗的篩選及制備
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞及菌株
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        3.1.4 溶液配制
    3.2 方法
        3.2.1 病毒免疫
        3.2.2 間接ELISA檢測免疫小鼠尾血血清效價(jià)
        3.2.3 細(xì)胞融合
        3.2.4 融合細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.5 陽性雜交瘤細(xì)胞篩選
        3.2.6 雜交瘤細(xì)胞的克隆化
        3.2.7 陽性克隆細(xì)胞株cDNA的調(diào)取與保存
        3.2.8 單抗的大量制備
        3.2.9 腹水單抗純化
        3.2.10 抗體純度分析
        3.2.11 單克隆抗體的鑒定及評價(jià)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 間接ELISA法檢測免疫后小鼠尾血血清效價(jià)
        3.3.2 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.3 陽性克隆細(xì)胞株cDNA的調(diào)取
        3.3.4 陽性克隆細(xì)胞株抗體可變區(qū)基因獲取
        3.3.5 抗體的大量制備與純化
        3.3.6 單克隆抗體的亞型鑒定
        3.3.7 單克隆抗體親和力的測定
        3.3.8 單克隆抗體的特異性鑒定
        3.3.9 穩(wěn)定性評價(jià)
        3.3.10 細(xì)胞ELISA鑒定單克隆抗體的結(jié)合能力
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 人源噬菌體抗體庫的篩選及表達(dá)
    4.1 材料
        4.1.1 菌株、噬菌體、質(zhì)粒及抗體庫
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        4.1.4 溶液配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 抗PD-L1 人源性抗體篩選
        4.2.2 全抗體表達(dá)及特異性評價(jià)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 以PD-L1 胞外區(qū)重組蛋白為抗原的噬菌體抗體庫篩選
        4.3.2 全抗表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.3 陽性克隆細(xì)胞株抗體可變區(qū)基因獲取
        4.3.4 人源全抗體的表達(dá)與純化
        4.3.5 單克隆抗體的特異性鑒定
    4.4 小結(jié)與討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷及在學(xué)期間研究成果
致謝



本文編號：3748211