發(fā)布時間：2023-01-03 10:11

　　mTOR屬于保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它能夠感知細胞周圍生長因子、氨基酸及能量信號,繼而參與維持細胞生長、增殖、代謝及存活等生命過程。mTOR由mTOR復(fù)合體1（mTORC1）及mTORC2構(gòu)成,其中mTORC1通過影響S6K及4E-BP1促進蛋白質(zhì)及核糖體的生成;mTORC2通過調(diào)節(jié)下游Akt、SGK1及PKC等AGC蛋白激酶家族磷酸化,對細胞存活、生長及代謝發(fā)揮重要作用。Sin1是mTORC2的重要組分之一,其在B細胞分化發(fā)育作用中的作用及機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)Sin1缺陷小鼠骨髓前體B細胞（pro/pre B）的比例顯著增加,而成熟B細胞（mature B）的比例顯著下降。在外周脾臟細胞分析中,Sin1缺陷小鼠的外周成熟B細胞比例明顯下降。進一步分析過渡期B（transitional B）細胞結(jié)果表明,Sin1缺陷小鼠過渡期T1 B細胞比例顯著上升,而過渡期T2/T3 B細胞比例下降,提示Sin1缺陷小鼠外周B細胞發(fā)育在T1 B時期出現(xiàn)發(fā)育阻滯。與此同時,Sin1缺陷小鼠B細胞大小從未成熟B（immature B）到T1、T2 B細胞時期均小于野生型（WT）組,且B細胞大小... 

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)
        1.1.1 雷帕霉素的發(fā)現(xiàn)起源
        1.1.2 mTOR的組成及功能
        1.1.3 mTOR信號網(wǎng)絡(luò)
        1.1.4 Sin1 概述
    1.2 B細胞發(fā)育及功能的研究進展回顧
        1.2.1 概述
        1.2.2 B細胞早期發(fā)育
        1.2.3 成熟B細胞的發(fā)育及其功能
    1.3 mTOR通路在B細胞的研究進展
        1.3.1 mTOR通路在B細胞發(fā)育及功能中的作用
        1.3.2 mTOR通路在生發(fā)中心B細胞形成及高親和力抗體生成中的作用
    1.4 mTOR通路在B細胞代謝方面的研究進展
        1.4.1 mTOR與 B細胞糖代謝的關(guān)系
        1.4.2 mTOR與 B細胞氧化磷酸化代謝的關(guān)系
第二章 實驗材料及方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 小鼠基因型鑒定引物
        2.1.2 主要實驗試劑
    2.2 主要實驗儀器及設(shè)備
    2.3 實驗動物
        2.3.1 條件性敲除小鼠
        2.3.2 骨髓移植嵌合體小鼠的構(gòu)建
    2.4 實驗方法
        2.4.1 小鼠DNA樣本制備
        2.4.2 PCR法鑒定小鼠基因型
        2.4.3 小鼠脾臟單細胞懸液制備
        2.4.4 小鼠淋巴結(jié)(腹股溝淋巴結(jié))單細胞懸液制備
        2.4.5 小鼠外周血單細胞制備
        2.4.6 小鼠骨髓單細胞制備及骨髓移植嵌合小鼠構(gòu)建
        2.4.7 流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子表達
        2.4.8 CFSE標記法檢測細胞增殖情況
        2.4.9 細胞/細胞核內(nèi)流式染色
        2.4.10 pro B細胞體外分化
        2.4.11 脾臟B細胞磁珠法富集
        2.4.12 細胞能量代謝檢測
        2.4.13 應(yīng)用T細胞依賴性抗原免疫小鼠
        2.4.14 ELISA法檢測血清中抗原特異性抗體
        2.4.15 HA免疫及PR8 流感病毒攻毒實驗
        2.4.16 ELISA法檢測小鼠血清中HA特異性抗體
        2.4.17 HE(hematoxylin and eosin)染色
        2.4.18 B細胞信號通路研究的Western樣本制備
        2.4.19 Westernblot技術(shù)檢測BCR介導(dǎo)的B細胞下游信號通路改變情況
        2.4.20 統(tǒng)計學分析
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 Sin1-mTORC2對B細胞分化、發(fā)育的影響
        3.1.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果
        3.1.2 Sin1 敲除小鼠B細胞發(fā)育阻滯
    3.2 Sin1-mTORC2對B細胞生長、代謝的影響
        3.2.1 Sin1 影響過渡期B細胞(transitional B)的大小
        3.2.2 Sin1 敲除導(dǎo)致B細胞凋亡增加
        3.2.3 Sin1 影響外周B細胞增殖功能及存活狀態(tài)
        3.2.4 Sin1 敲除導(dǎo)致B細胞糖酵解及有氧呼吸代謝水平下降
    3.3 Sin1-mTORC2對B細胞功能的影響
        3.3.1 ROSA26-Cre-ERT2Sin1fl/-小鼠產(chǎn)生特異性抗體水平受損
        3.3.2 Cd19CreSin1fl/fl小鼠血清中特異性抗體水平檢測
    3.4 Sin1-mTORC2 在甲型H1N1 流感模型中的作用初探
        3.4.1 Sin1 WT及 KO小鼠在HA血清凝集素蛋白初次免疫后特異性抗體生成情況
        3.4.2 Sin1 WT及 KO小鼠在HA抗原肽加強免疫后特異性抗體生成情況
        3.4.3 PR8 攻毒后小鼠體重變化及存活情況
        3.4.4 PR8 攻毒后小鼠肺部組織切片形態(tài)學觀察
        3.4.5 Sin1 WT及 KO小鼠在PR8 攻毒后特異性抗體生成情況
    3.5 Sin1在BCR介導(dǎo)的信號通路中的作用
        3.5.1 Sin1 敲除小鼠B細胞內(nèi)Akt Ser473 磷酸化水平降低
        3.5.2 Sin1 缺陷小鼠B細胞在BCR信號激活后介導(dǎo)的mTORC1 活化程度減弱
        3.5.3 Sin1-mTORC2 通過調(diào)控c-Myc表達水平影響B(tài)細胞生長
        3.5.4 Sin1/mTOR通過抑制GSK3 激酶的活性進而維持c-Myc的蛋白穩(wěn)定性
第四章 全文總結(jié)及模式圖
    4.1 全文總結(jié)
    4.2 工作示意圖
    4.3 全文討論
第五章 致謝
第六章 參考文獻



本文編號：3727271