發(fā)布時間：2017-05-15 07:37

  本文關(guān)鍵詞：沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pORF5引起的宿主差異蛋白的篩選及功能初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)p ORF5(pgp3)是由質(zhì)�；蚓幋a的唯一一種分泌到宿主細(xì)胞胞漿中的分泌性質(zhì)粒蛋白,與毒力密切相關(guān),但p ORF5在Ct致病過程中的分子機(jī)制和功能還不甚明了。本研究試圖探討在Ct致病過程中與質(zhì)粒蛋白p ORF5相互作用的宿主蛋白及其功能,為深入研究Ct的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。構(gòu)建p ORF5基因慢病毒表達(dá)載體,與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒,收集慢病毒后感染He La細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)多次分選篩選陽性細(xì)胞克隆,獲得p ORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的He La細(xì)胞系(p ORF5-He La細(xì)胞系)和對照He La細(xì)胞系,實(shí)時定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting分別鑒定p ORF5的m RNA和蛋白表達(dá)水平。采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(i TRAQ)技術(shù)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)技術(shù)建立p ORF5-He La細(xì)胞系和對照He La細(xì)胞系的全細(xì)胞蛋白表達(dá)譜,構(gòu)建差異蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫;q RT-PCR驗(yàn)證部分差異蛋白m RNA的表達(dá)水平。應(yīng)用DAVID在線生物信息學(xué)分析軟件、在線STRING軟件分析和在線KEGG PATHWAY Database軟件分析等生物信息學(xué)方法對差異蛋白進(jìn)行GO(基因本體)分子功能注釋、蛋白質(zhì)相互作用及KEGG信號通路分析,預(yù)測差異表達(dá)蛋白生物學(xué)功能。構(gòu)建高遷移率族蛋白B1(HMGB1)基因RNAi慢病毒表達(dá)載體,利用三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)生產(chǎn)sh RNA-HMGB1病毒,收集病毒上清,并感染He La細(xì)胞,建立穩(wěn)定干擾HMGB1表達(dá)的p ORF5-He La細(xì)胞系及空白載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞系;采用q RT-PCR和Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3的表達(dá);采用流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下:1.成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)p ORF5的He La細(xì)胞系和對照細(xì)胞系;2.采用i TRAQ標(biāo)記結(jié)合2D LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)共鑒定了314個差異表達(dá)的宿主蛋白,其中159個蛋白表達(dá)上調(diào),155個蛋白表達(dá)下調(diào)。GO功能注釋顯示:差異蛋白的功能主要涉及分子功能、細(xì)胞組分功能和生物學(xué)進(jìn)程功能三方面。分子功能方面包括:①蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能,如核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶Ⅱ激活因子p15等;②核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能,如高遷移率族蛋白B1、高遷移率族蛋白B2等。細(xì)胞組分功能方面包括:①參與細(xì)胞分裂增殖,如氯離子通道蛋白1、膜聯(lián)蛋白A1等;②參與細(xì)胞連接,如α-輔肌動蛋白-4、整合蛋白α-6等。在生物學(xué)進(jìn)程功能方面:部分差異蛋白參與細(xì)胞繁殖過程,如運(yùn)鐵蛋白受體蛋白-1、60S酸性核糖體蛋白P2等;部分差異蛋白參與細(xì)胞免疫反應(yīng)過程,如補(bǔ)體C9、補(bǔ)體衰退加速因子等;部分差異蛋白參與細(xì)胞死亡,如角蛋白、抑制蛋白-1等。STRING軟件分析結(jié)果顯示:各差異表達(dá)蛋白之間存在著直接和間接的相互作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示:差異蛋白與多條信號通路相關(guān),主要涉及了核糖體通路、剪接體通路、ECM受體相互作用通路、MAPK信號通路和p53信號通路等;3.q RT-PCR證實(shí)p ORF5-He La細(xì)胞中PARK7、HMGB1、HMGB2、HBA1和HIST1H1C表達(dá)上調(diào),CDKN2A、SFN、KRT7、CLIC1表達(dá)下調(diào),Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證HMGB1和PARK7蛋白質(zhì)在p ORF5-He La細(xì)胞表達(dá)水平升高,與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致;4.與對照細(xì)胞比較,穩(wěn)定干擾HMGB1的p ORF5-He La細(xì)胞的自噬蛋白Beclin-1和LC-3m RNA表達(dá)明顯降低,分別降低了62%和89.8%。Western blotting結(jié)果顯示,與對照細(xì)胞比較,穩(wěn)定干擾HMGB1的p ORF5-He La細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1明顯下降;LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比率小于對照組,LC3-Ⅱ表達(dá)降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾HMGB1的p ORF5-He La細(xì)胞的凋亡率明顯增加,增加了18.84%;細(xì)胞周期也發(fā)生了改變,G2和S期細(xì)胞分別增加了4.44%和3.4%。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:1.成功構(gòu)建p ORF5所引起的宿主差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)庫,鑒定到差異蛋白314個,其中上調(diào)159個,下調(diào)155個,與細(xì)胞免疫反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物粘附有關(guān);2.p ORF5可通過上調(diào)宿主蛋白HMGB1,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：沙眼衣原體 質(zhì)粒蛋白p ORF5 同位素標(biāo)記相對和絕對定量 高遷移率族蛋白B1
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R374
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 主要中英文縮寫12-15
• 第1章 緒論15-19
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料19-25
• 2.1 主要儀器19-20
• 2.2 慢病毒載體、菌株及細(xì)胞株20
• 2.3 主要試劑盒20
• 2.4 主要試劑20-22
• 2.5 生物信息學(xué)軟件22-23
• 2.6 其他23-25
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法25-43
• 3.1 p ORF5基因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系的建立25-28
• 3.2 p ORF5慢病毒的包裝28-29
• 3.3 p ORF5慢病毒感染He La細(xì)胞29
• 3.4 q RT-PCR檢測p ORF5基因的表達(dá)水平29-30
• 3.5 Western blotting檢測p ORF5蛋白的表達(dá)30-32
• 3.6 i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定p ORF5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對照組差異表達(dá)蛋白32-36
• 3.7 生物信息學(xué)分析36-37
• 3.8. q RT-PCR驗(yàn)證部分差異蛋白的m RNA表達(dá)37-38
• 3.9 Western blotting驗(yàn)證部分差異蛋白的表達(dá)38
• 3.10 HMGB1功能的初步研究38-41
• 3.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41-43
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-63
• 4.1 p ORF5基因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系的建立43-47
• 4.2 i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定p ORF5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對照組中差異表達(dá)蛋白47-55
• 4.3 q RT-PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白的m RNA表達(dá)水平55
• 4.4 Western blotting驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平55-56
• 4.5 HMGB1功能的初步研究56-63
• 第5章 討論63-67
• 第6章 結(jié)論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 文獻(xiàn)綜述73-79
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果79-81
• 本研究受以下基金資助81-83
• 致謝83

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本文編號：367133