本文關(guān)鍵詞：陽(yáng)離子抗菌肽原核及真核分泌表達(dá)體系的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：陽(yáng)離子抗菌肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗菌活性的小分子多肽物質(zhì),是進(jìn)化上保守的天然免疫重要活性分子。由于抗菌肽天然來(lái)源有限,化學(xué)合成價(jià)格昂貴；而利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽周期短、產(chǎn)量高、活性強(qiáng)；目前這種方法已成為生產(chǎn)抗菌肽的理想方法。陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)大腸桿菌有殺傷作用,而且自身易被宿主蛋白酶降解,因此我們?cè)诳咕牡腘端加上含負(fù)電荷的融合頭,中和抗菌肽上的正電荷,抑制其對(duì)宿主的毒性。切除融合頭一直都是抗菌肽融合表達(dá)的重要步驟。酶法切割成本極高；化學(xué)切割中溴化氫有劇毒,難以大規(guī)模使用；本實(shí)驗(yàn)在融合頭和抗菌肽之間引入Asp-Pro酸敏感位點(diǎn),酸特異性切割去除融合頭；便于操作,成本低廉。本實(shí)驗(yàn)所用的融合頭是Cherry,它可能具有促進(jìn)融合蛋白分泌到培養(yǎng)上清中的能力；但并不能保證融合蛋白全部分泌出去。而本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)過(guò)程中加入甘氨酸,它可以干擾細(xì)胞壁肽聚糖層的合成,破壞細(xì)胞外膜的完整性,導(dǎo)致周質(zhì)空間內(nèi)蛋白質(zhì)包括融合蛋白的釋放,進(jìn)而提高分泌效率。Pleurocidin是從刺泥鰈的皮膚粘液中分離出的含25個(gè)氨基酸殘基的線性多肽,具有廣譜的抗菌活性,能夠抑制多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性致病菌及真菌。Pleurocidin基因片段和Cherry DNA序列尾通過(guò)平末端連接組成融合基因,再將融合基因連接到pET22b(+)載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。用4 g/L乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌20 h,在誘導(dǎo)16h時(shí)加入終濃度4g/L甘氨酸,融合蛋白成功表達(dá),幾乎全部分泌到培養(yǎng)上清中,融合蛋白產(chǎn)量達(dá)到516μg/mL Pleurocidin和Cherry尾之間有Asp-Pro酸敏感位點(diǎn),向培養(yǎng)上清液中加稀鹽酸,使其終濃度為100mmol/L,在65℃水浴鍋中水解72 h,得到r-Pleurocidin。Pleurocidin對(duì)大腸桿菌DH5a和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性。牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)是牛乳鐵蛋白在酸性環(huán)境中經(jīng)胃蛋白酶水解,從N-端釋放的結(jié)構(gòu)域,含25個(gè)氨基酸殘基,具有廣泛、高效的抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)抗菌肽在釀酒酵母中的分泌表達(dá)進(jìn)行了研究,用組成型啟動(dòng)子TPI替換pYES2質(zhì)粒中的GAL1啟動(dòng)子,以LfcinB為目的抗菌肽,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYES2-TPI-LfcinB,將其電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl,通過(guò)尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基(SC-U培養(yǎng)基)篩選陽(yáng)性克隆,獲得了釀酒酵母pYES2-TPI-LfcinB菌株。該菌株在培養(yǎng)過(guò)程中,不需誘導(dǎo),LfcinB可以直接分泌表達(dá)；不存在葡萄糖抑制LfcinB表達(dá)的問(wèn)題。對(duì)培養(yǎng)上清做抑菌實(shí)驗(yàn)證明：LfcinB對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有明顯的抑菌活性。此實(shí)驗(yàn)為抗菌肽在釀酒酵母中的組成型分泌表達(dá)提供了技術(shù)支持,具有一定的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：Pleurocidin 分泌表達(dá) Asp-Pro酸敏感位點(diǎn) 牛乳鐵蛋白肽 組成型表達(dá) 釀酒酵母
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-11
• 第一章 引言11-23
• 1.1 抗菌肽11-17
• 1.1.1 抗菌肽的分類(lèi)11-13
• 1.1.2 抗菌肽的理化性質(zhì)13
• 1.1.3 抗菌肽的作用機(jī)制13-14
• 1.1.4 抗菌肽的生物活性14-16
• 1.1.5 抗菌肽的應(yīng)用前景16-17
• 1.2 抗菌肽的表達(dá)研究進(jìn)展17-20
• 1.2.1 抗菌肽的來(lái)源17
• 1.2.2 抗菌肽的原核表達(dá)體系17-19
• 1.2.3 抗菌肽的真核表達(dá)體系19-20
• 1.3 存在的問(wèn)題20-21
• 1.4 本文的研究?jī)?nèi)容和意義21-23
• 1.4.1 本文的研究?jī)?nèi)容21
• 1.4.2 本文的研究意義21-23
• 第二章 陽(yáng)離子抗菌肽Pleurocidin在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)23-55
• 引論23
• 2.1 材料23-28
• 2.1.1 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.1.2 主要試劑24
• 2.1.3 菌株及載體24-25
• 2.1.4 主要溶液劑試劑配制25-28
• 2.2 方法28-40
• 2.2.1 搭橋引物PCR合成Pleurocidin基因片段28-30
• 2.2.2 Pluerocidin在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)30-35
• 2.2.3 融合蛋白Cherry-Pleurocidin在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)35-40
• 2.3 結(jié)果40-53
• 2.3.1 搭橋引物PCR擴(kuò)增結(jié)果40-41
• 2.3.2 含雙酶切位點(diǎn)的Pleurocidin基因片段PCR結(jié)果41-42
• 2.3.3 含單酶切位點(diǎn)的Pleurocidin和Cherry基因片段的PCR結(jié)果42-43
• 2.3.4 融合基因Cherry-Pleurocidin的PCR擴(kuò)增結(jié)果43
• 2.3.5 篩選陽(yáng)性克隆43-44
• 2.3.6 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)44-45
• 2.3.7 乳糖誘導(dǎo)組和乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組SDS-PAGE比較45-46
• 2.3.8 Lowry法測(cè)蛋白濃度46-47
• 2.3.9 乳糖誘導(dǎo)組和乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組的配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)47-48
• 2.3.10 融合蛋白酸特異性切割48-49
• 2.3.11 Pleurocidin的純化結(jié)果49-50
• 2.3.12 Pleurocidin的抑菌活性鑒定50-51
• 2.3.13 Pleurocidin的質(zhì)譜分析51-53
• 2.4 討論53-55
• 第三章 pYES2質(zhì)粒啟動(dòng)子改造及其在釀酒酵母異源基因表達(dá)中的應(yīng)用55-69
• 引論55-56
• 3.1 材料56-57
• 3.1.1 主要儀器設(shè)備56
• 3.1.2 菌株和載體56
• 3.1.3 主要試劑56
• 3.1.4 常用試劑配制方法56-57
• 3.2 方法57-61
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成57
• 3.2.2 TPI啟動(dòng)子和質(zhì)粒pYES2-α-LfcinB的PCR反應(yīng)57
• 3.2.3 TPI啟動(dòng)子和質(zhì)粒pYES2-α-LfcinB的磷酸化與平末端連接57-58
• 3.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞58
• 3.2.5 篩選陽(yáng)性克隆58
• 3.2.6 提取重組質(zhì)粒pYES2-TPI-LfcinB58-59
• 3.2.7 釀酒酵母INVScl感受態(tài)細(xì)胞的制備59
• 3.2.8 重組質(zhì)粒pYES2-TPI-LfcinB轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc159-60
• 3.2.9 篩選釀酒酵母陽(yáng)性克隆60
• 3.2.10 釀酒酵母pYES2-TPI-LfcinB的培養(yǎng)60
• 3.2.11 釀酒酵母pYES2-TPI-LfcinB培養(yǎng)上清抑菌活性的檢測(cè)60-61
• 3.3 結(jié)果61-67
• 3.3.1 TPI啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增結(jié)果61-62
• 3.3.2 pYES2質(zhì)粒的PCR結(jié)果62-63
• 3.3.3 pYES2-TPI-LfcinB菌株的OD600檢測(cè)結(jié)果63-64
• 3.3.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Lfcin B的表達(dá)活性的影響64-65
• 3.3.5 不同體積培養(yǎng)上清SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果65-66
• 3.3.6 LfcinB的抑菌活性研究66-67
• 3.4 討論67-69
• 第四章 總結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 致謝77-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫偉;沈以紅;向仲懷;張澤;;家蠶抗菌肽基因研究進(jìn)展[J];蠶業(yè)科學(xué);2009年01期

2 黎觀紅;洪智敏;賈永杰;瞿明仁;;抗菌肽的抗菌作用及其機(jī)制[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2011年04期

3 韋巖;;抗菌肽的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用[J];菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào);2007年01期

4 王浩波;;抗菌肽的研究進(jìn)展及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];畜牧與飼料科學(xué);2015年01期

5 蘇蕾;馬玉貞;張廣洲;;新型抗生素的研究進(jìn)展及研發(fā)趨勢(shì)探討[J];齊魯藥事;2007年08期

6 李忠清;王亮;;牛乳鐵蛋白肽的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J];食品科學(xué);2011年13期

7 賴(lài)玉平,彭沂非,郁正艷,黃靜,吳自榮;DCD-1L在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)[J];中國(guó)生物工程雜志;2004年02期

8 李永建;嚴(yán)明;丁莉;許偉;許琳;yh;;在釀酒酵母中共表達(dá)XYLA和XKS1基因后利用木糖的初步研究[J];生物加工過(guò)程;2006年04期

9 邱曉燕;抗菌肽的免疫功能和應(yīng)用前景[J];生物學(xué)通報(bào);2002年01期

10 馬利娟;查向東;車(chē)媛媛;徐雪姣;吳敵;孔小衛(wèi);;牛乳鐵蛋白肽在釀酒酵母中的分泌表達(dá)及其活性[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年09期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉紅珍;兔腸源抗菌蛋白的分離純化及其生物活性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：陽(yáng)離子抗菌肽原核及真核分泌表達(dá)體系的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：366201