銅綠假單胞菌芳香硫酸酯酶（Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS）是生化制藥工具酶及潛在免疫分析標記酶,可與堿性磷酸酶配對應(yīng)用于SDESA-ELISA。然而野生型PAAS催化活性低,對其進行酶分子工程改造是提高催化活性的有效策略。課題組前期建立了基于雙酶融合表達測定酶突變體相對標簽酶活性比值的突變體庫高通量篩選方法。該方法用于PAAS突變體庫篩選時,通過構(gòu)建ECAP-PAAS融合表達蛋白,以大腸桿菌堿性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP）為標簽酶,PAAS為目標酶,采用光度法單通道雙酶同測（SDESA）測定PAAS/突變體與ECAP的活力比值作為篩選指標。分別以堿裂解與超聲裂解對M72位突變體制備粗酶液并測定活力比值。兩種裂解方法所得粗酶液活力比值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,因此選取適合高通量篩選體系的堿裂解制備粗酶液。通過測定大腸桿菌細胞裂解液中ECAP的本底表達確定篩選閾值;當ECAP活力≥0.0053 kU/L時,認為雙酶融合表達蛋白表達成功。雙酶融合表達聯(lián)合48孔板培養(yǎng)、堿裂解、96孔板... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 融合表達高通量篩選方法的評價
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
第二部分 定點飽和突變建庫方案的比較
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
第三部分 獲得高活性PAAS突變體的新策略
    1 PAAS保守性分析
    2 基于計算分析的半理性設(shè)計
    3 聯(lián)用隨機突變與迭代飽和突變獲得高活性突變體
全文總結(jié)
綜述
參考文獻
致謝
碩士期間發(fā)表論文



本文編號：3644141