銅綠假單胞菌芳香硫酸酯酶（Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS）是生化制藥工具酶及潛在免疫分析標(biāo)記酶,可與堿性磷酸酶配對(duì)應(yīng)用于SDESA-ELISA。然而野生型PAAS催化活性低,對(duì)其進(jìn)行酶分子工程改造是提高催化活性的有效策略。課題組前期建立了基于雙酶融合表達(dá)測(cè)定酶突變體相對(duì)標(biāo)簽酶活性比值的突變體庫(kù)高通量篩選方法。該方法用于PAAS突變體庫(kù)篩選時(shí),通過(guò)構(gòu)建ECAP-PAAS融合表達(dá)蛋白,以大腸桿菌堿性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP）為標(biāo)簽酶,PAAS為目標(biāo)酶,采用光度法單通道雙酶同測(cè)（SDESA）測(cè)定PAAS/突變體與ECAP的活力比值作為篩選指標(biāo)。分別以堿裂解與超聲裂解對(duì)M72位突變體制備粗酶液并測(cè)定活力比值。兩種裂解方法所得粗酶液活力比值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此選取適合高通量篩選體系的堿裂解制備粗酶液。通過(guò)測(cè)定大腸桿菌細(xì)胞裂解液中ECAP的本底表達(dá)確定篩選閾值;當(dāng)ECAP活力≥0.0053 kU/L時(shí),認(rèn)為雙酶融合表達(dá)蛋白表達(dá)成功。雙酶融合表達(dá)聯(lián)合48孔板培養(yǎng)、堿裂解、96孔板... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 融合表達(dá)高通量篩選方法的評(píng)價(jià)
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
第二部分 定點(diǎn)飽和突變建庫(kù)方案的比較
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
第三部分 獲得高活性PAAS突變體的新策略
    1 PAAS保守性分析
    2 基于計(jì)算分析的半理性設(shè)計(jì)
    3 聯(lián)用隨機(jī)突變與迭代飽和突變獲得高活性突變體
全文總結(jié)
綜述
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表論文



本文編號(hào)：3644141