目的:利用單堿基編輯技術(shù)定點(diǎn)修飾MECP2基因T158M位點(diǎn),獲得單一定點(diǎn)突變類型的嚙齒類及非人靈長(zhǎng)類胚胎,為建立模擬臨床上Rett綜合征的疾病動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。方法:利用單堿基編輯技術(shù)構(gòu)建3對(duì)T158M-sgRNA質(zhì)粒,并分別與BE系統(tǒng)（BE3或BE4max）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞篩選高效的sgRNA,通過顯微注射將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA以不同的濃度組合注射到ICR小鼠和獼猴受精卵中,檢測(cè)小鼠和獼猴胚胎發(fā)育率和編輯效率,評(píng)估BE3和BE4max的工作效率及最優(yōu)濃度組合。結(jié)果:小鼠胚胎上BE4max（ng/μl）∶sgRNA（ng/μl）=100∶50濃度組合時(shí),小鼠胚胎發(fā)育率和編輯效率最佳,同時(shí)該濃度組合在獼猴胚胎上也獲得了有效編輯效率。結(jié)論:成功在小鼠及獼猴胚胎上實(shí)現(xiàn)了MECP2基因T158M位點(diǎn)上C→T的轉(zhuǎn)變,為后期建立T158M突變的RTT動(dòng)物模型建立了穩(wěn)定的胚胎編輯體系。 

【文章來源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

為了探究BE質(zhì)粒和sgRNA的mRNA最佳濃度以及質(zhì)量控制后mRNA對(duì)胚胎發(fā)育的穩(wěn)定性，選取了小鼠胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共用了4個(gè)濃度組合(BE4maxP2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20、100∶50和200∶100)，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果表明不同注射濃度對(duì)胚胎發(fā)育率和編輯效率影響不同。低濃度組合(BE4max-P2A-GFP∶T158M-sgRNA=20∶10、50∶20)囊胚發(fā)育率較高，但統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)被編輯的胚胎個(gè)數(shù)少，突變率(指通過Sanger測(cè)序分析胚胎是100%純合突變還是嵌合體，嵌合突變的比例)低。濃度組合為200∶100時(shí)，突變率高而囊胚率較低。綜上結(jié)果，篩選了100∶50為胚胎注射的最優(yōu)組合(表5)，運(yùn)用T7酶切和Sanger測(cè)序的方法測(cè)定編輯后胚胎基因組序列并觀察基因測(cè)序峰圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)在設(shè)計(jì)的sgRNA序列PAM位點(diǎn)(從5"～3")第5個(gè)和第7個(gè)堿基出現(xiàn)了C→T的突變，第5個(gè)堿基由C→T，基因序列由TTC變成TTT，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，并沒有改變氨基酸的類型，依然為苯丙氨酸，而第7個(gè)堿基由C→T的突變，引起了氨基酸由蘇氨酸改變?yōu)榧琢虬彼幔f明了BE基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的定點(diǎn)突變。圖3 小鼠胚胎驗(yàn)證

小鼠胚胎驗(yàn)證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基因編輯之“新寵”—單堿基基因組編輯系統(tǒng)[J]. 魏瑜,張曉輝,李大力.  遺傳. 2017(12)



本文編號(hào)：3523310