乙醛脫氫酶（ALDH）是參與人體酒精代謝的關(guān)鍵酶之一,ALDH是一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族,其中能夠參與酒精代謝的主要是位于肝臟線粒體的ALDH2。ALDH2可將酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸,從而減輕乙醛的毒害作用。但是很多人缺乏正常的ALDH2,易引起酒精中毒。近年來(lái),隨著人們健康意識(shí)的提高,對(duì)解酒護(hù)肝藥物和制劑的需求越來(lái)越明顯,因而對(duì)ALDH2的研究更顯得意義深遠(yuǎn)。目前商業(yè)化的ALDH2主要從動(dòng)物肝臟或肝細(xì)胞線粒體中提取,價(jià)格昂貴,難以大規(guī)模生產(chǎn)。本課題旨在采用基因工程的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體,導(dǎo)入到大腸桿菌中,利用微生物發(fā)酵大量制備ALDH2,并通過(guò)密碼子優(yōu)化,提高重組ALDH2的表達(dá)量。具體研究如下:1、從肝癌細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后PCR擴(kuò)增獲得Aldh2片段,并將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T-simple載體,轉(zhuǎn)化五.cCliDH5α,抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序,以確保目的基因連接至克隆載體,同源比對(duì)分析顯示序列同源性為100%。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Mde I將質(zhì)粒pMD19-T-ALDH2中的目的基因切下,亞克隆至同樣雙酶切的線性化質(zhì)粒... 

【文章來(lái)源】：浙江工商大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：97 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１?ＡＬＤＨ２?ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物??Ｍ：?ＤＳ?５０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－３：?ＡＬＤＨ２?ＰＣＲ?產(chǎn)物??

ＴＵＭＵ?丨（４６０丨＾ＨｃｏＮＩ（Ｍ２７）??Ｈｐａ?ｌｏｔ?（３９６２）?里龍應(yīng)??圖２－３重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２的構(gòu)建??Ｆｉｇ．?２－３?Ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２??２．３．４．２?ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２?酶切鑒定??ｐＭＤ１９－Ｔ－ＡＬＤＨ２?經(jīng)?ＡＷｅ?Ｉ、￡ｃｏ／？?１?雙酶切后回收?片段（圖?２－４?的?１、２??泳道），克隆入同樣經(jīng)ＡＷｅ?Ｉ、五ｃｏ／Ｍ雙酶切處理的質(zhì)粒ｐＥＴ４４ｂ⑴中（圖２－４的３、??４泳道，轉(zhuǎn)化五．ｃｏ／／ＢＬ２１（ＤＥ３）。３７°Ｃ倒置培養(yǎng)１６？２０ｈ，用接種環(huán)挑取單菌落??接種于５?ｍＬ含Ａｍｐ的ＬＢ培養(yǎng)基。抽提重組質(zhì)粒ｐＥＴ４４ｂ－ＡＬＤＨ２，然后用??Ｉ、五ｏ＾Ｉ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物跑１％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，如圖２－４（Ｂ）??所示在５６００ｂｐ和１５００ｂｐ處各有一條條帶，得到與預(yù)期片段大小一致的線性化質(zhì)??粒ｐＥＴ４４ｂ（＋）和ＡＬＤＨ２的目的基因片段，表明」碰２片段已成功克隆到ｐＥＴ４４ｂ（＋）??表達(dá)載體中。??２５??

基于此類(lèi)研宄，對(duì)ｄ／辦２進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以期提高該基因在大腸桿菌中的表達(dá)??水平。密碼子適應(yīng)指數(shù)（ＣＡＩ）指的是編碼區(qū)同義密碼子與最佳密碼子使用頻率的??相符程度，取值范圍是０？１，數(shù)值越大代表基因的表達(dá)水平越高［７３］。從圖３－１可??以看出優(yōu)化前基因的ＣＡＩ為０．７３，而優(yōu)化后的ＣＡＩ達(dá)到０．９６，明顯高于優(yōu)化前，??并且ＣＡＩ數(shù)值接近于１，己經(jīng)達(dá)到了較高的水平。??Ｃｏｄｏｎ?Ｉ＇ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??ｉｊｌｌｌｌｌｌＵＪｌｌｊ＾??ＣＡＩ?，０．７３?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??Ｃｏｄｏｎ?ｌ?ｓｅｇｅ?Ａｄｊｕｓｔ??Ｓ?Ｓ?５?§?５?５?２?Ｍ?§?５?Ｍ?Ｉ?３?ｓ?３?５?３?Ｓ?３?Ｍ?Ｍ?§?ｇ?５?§?Ｈ?ｇ？?２?２?３??Ｃ＇ＡＩ?＊０?９６?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?Ｃｏｄｏｎ??圖３－１優(yōu)化前（Ａ）后（Ｂ）密碼子適應(yīng)指數(shù)（ＣＡＩ）的對(duì)比??Ｆｉｇ．３－１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｃｏｄｏｎ?ａｄａｐｔａｔｉｏｎ?ｉｎｄｅｘ?（ＣＡＩ）?ｂｅｆｏｒｅ?（Ａ）ａｎｄ?ａｆｔｅｒ（Ｂ）??ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??３．３．２．２?ＧＣ含置分析??ＧＣ含量會(huì)影響ＤＮＡ密度，影響ＤＮＡ變性的難易程度。ＧＣ含量的理想百??分比范圍在３０％？７０％之間

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]酶法不對(duì)稱(chēng)合成（3R,5R）-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯[D]. 劉玉婷.浙江大學(xué) 2017
[2]人乙醛脫氫酶2的表達(dá)及其在緩解小鼠急性酒精中毒中的研究[D]. 黃錕.武漢工程大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3522840