目的觀察低氧條件下HIF-1α/VEGF/Notch信號(hào)通路在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）血管生成中的作用。方法將HUVEC進(jìn)行常氧和低氧[二氯化鈷 （CoCl2）,200 μmol/L]誘導(dǎo),再將常氧和低氧處理的HUVEC應(yīng)用Notch1信號(hào)通路的抑制劑DAPT （30 μmol/L,24 h）和激活劑JAG-1 （30 μmol/L,24 h）干預(yù)。通過(guò)體外小管形成實(shí)驗(yàn)觀察低氧對(duì)HUVEC血管生成能力的影響。應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)HUVEC中低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （MMP-9）和Notch1信號(hào)分子 （Notch1、Dell4和JAG-1）的mRNA和蛋白表達(dá)。通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)觀察低氧、DAPT、JAG-1對(duì)HUVEC遷移能力的影響。應(yīng)用MTT法檢測(cè)低氧及Notch1對(duì)HUVEC增殖的影響。兩組間比較采用t檢驗(yàn),采用析因設(shè)計(jì)方差分析低氧和DAPT以及低氧和JAG-1對(duì)HUVEC遷移能力、距離、小管形成能力和細(xì)胞增殖的交互作用。結(jié)果與常氧組比較,低氧組小管總長(zhǎng)[（... 

【文章來(lái)源】：中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版). 2020,10(03)

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【部分圖文】：

倒置相差顯微鏡下觀察不同組0和24 h HUVEC細(xì)胞傷口愈合 (×100)

表6 低氧及DAPT、JAG-1對(duì)HUVEC小管總長(zhǎng)的影響(mm,) 低氧 DAPT 平均 JAG-1 平均 否 是 否 是 否 5.52±0.87 4.13±0.57 4.83±0.92 5.52±0.36 14.62±1.28 10.07±5.62 是 15.4 ±1.24 7.42±0.70 11.41±4.96 15.4 ±1.11 17.32±1.63 16.36±2.27 平均 10.46±5.53 5.78±2.04 8.12±6.53 10.46±5.22 15.97±3.12 13.22±7.46討 論

用Trizol試劑根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明從HUVEC中提取總RNA。使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒將總RNA (1 μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列如表1所示。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix (QPK-201)在Mx3000pTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL,其中包括1 μL引物、10 μL MixSYBR、1 μL cDNA和6 μL H2O。反應(yīng)條件如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因。使用2-△△Ct方法進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表1 引物序列信息 名稱 序列(5＇→3＇) 預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) Notch1 上游GGC CGT GTA AGT GTG GTC AGA GC 168 下游 CCT CAG CGT TCG TTT GTA CTG A Dell4 上游CTT GGA GCA GCG CTG GAG TAC 69 下游CCG CTG CAC ACT TCT TGG TCC JAG-1 上游TCT GGG AGT CCC ATG GAA GC 73 下游TAG CAG TGC CCC TAG CTG CCA 低氧誘導(dǎo)因子1α 上游GGT ACG TTC GTT TGC ATG TCG AGC 222 下游CCT CAG CGA TAC TGA GGT GGT 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 上游GGC TAC CCG CCA CTT CTC AGC 564 下游CTG CTT GAT GGT GGA ACC 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 上游CCG CGT GCG AGT CCC TGG TCT G 300 下游CTG ACA TGG AAG TCC ATA GCA G GAPDH 上游GCA GAA AAG CCG GGT GAG GGG 229 下游 TGG CAA TGG GCG GTG GTG ATG


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