目的觀察低氧條件下HIF-1α/VEGF/Notch信號通路在人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）血管生成中的作用。方法將HUVEC進行常氧和低氧[二氯化鈷 （CoCl2）,200 μmol/L]誘導,再將常氧和低氧處理的HUVEC應用Notch1信號通路的抑制劑DAPT （30 μmol/L,24 h）和激活劑JAG-1 （30 μmol/L,24 h）干預。通過體外小管形成實驗觀察低氧對HUVEC血管生成能力的影響。應用RT-PCR和Western blot檢測HUVEC中低氧誘導因子-1α （HIF-1α）、血管內皮生長因子 （VEGF）、基質金屬蛋白酶-9 （MMP-9）和Notch1信號分子 （Notch1、Dell4和JAG-1）的mRNA和蛋白表達。通過Transwell遷移實驗和傷口愈合實驗觀察低氧、DAPT、JAG-1對HUVEC遷移能力的影響。應用MTT法檢測低氧及Notch1對HUVEC增殖的影響。兩組間比較采用t檢驗,采用析因設計方差分析低氧和DAPT以及低氧和JAG-1對HUVEC遷移能力、距離、小管形成能力和細胞增殖的交互作用。結果與常氧組比較,低氧組小管總長[（... 

【文章來源】：中華細胞與干細胞雜志(電子版). 2020,10(03)

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倒置相差顯微鏡下觀察不同組0和24 h HUVEC細胞傷口愈合 (×100)

表6 低氧及DAPT、JAG-1對HUVEC小管總長的影響(mm,) 低氧 DAPT 平均 JAG-1 平均 否 是 否 是 否 5.52±0.87 4.13±0.57 4.83±0.92 5.52±0.36 14.62±1.28 10.07±5.62 是 15.4 ±1.24 7.42±0.70 11.41±4.96 15.4 ±1.11 17.32±1.63 16.36±2.27 平均 10.46±5.53 5.78±2.04 8.12±6.53 10.46±5.22 15.97±3.12 13.22±7.46討 論

用Trizol試劑根據(jù)生產廠商的說明從HUVEC中提取總RNA。使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒將總RNA (1 μg)反轉錄成cDNA。引物序列如表1所示。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix (QPK-201)在Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀上進行RT-PCR。反應體系為20 μL,其中包括1 μL引物、10 μL MixSYBR、1 μL cDNA和6 μL H2O。反應條件如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。GAPDH作為內參基因。使用2-△△Ct方法進行mRNA相對表達量的計算。實驗重復3次。表1 引物序列信息 名稱 序列(5＇→3＇) 預期擴增長度(bp) Notch1 上游GGC CGT GTA AGT GTG GTC AGA GC 168 下游 CCT CAG CGT TCG TTT GTA CTG A Dell4 上游CTT GGA GCA GCG CTG GAG TAC 69 下游CCG CTG CAC ACT TCT TGG TCC JAG-1 上游TCT GGG AGT CCC ATG GAA GC 73 下游TAG CAG TGC CCC TAG CTG CCA 低氧誘導因子1α 上游GGT ACG TTC GTT TGC ATG TCG AGC 222 下游CCT CAG CGA TAC TGA GGT GGT 血管內皮生長因子 上游GGC TAC CCG CCA CTT CTC AGC 564 下游CTG CTT GAT GGT GGA ACC 基質金屬蛋白酶-9 上游CCG CGT GCG AGT CCC TGG TCT G 300 下游CTG ACA TGG AAG TCC ATA GCA G GAPDH 上游GCA GAA AAG CCG GGT GAG GGG 229 下游 TGG CAA TGG GCG GTG GTG ATG


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