目的表達(dá)獲得較純的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)AgB8/3重組抗原（rEgAgB8/3）。方法根據(jù)GeneBank登陸號(hào)（AF362442）下載目的基因核酸序列,利用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物,對(duì)EgAgB8/3編碼分泌型多肽片段的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序鑒定其正確性后定向連入原核表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ER2566,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后進(jìn)行純化,用SDS-PAGE電泳和western blot分析鑒定融合蛋白與目的蛋白rEgAgB8/3的表達(dá)量和純度。結(jié)果成功克隆獲得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重組表達(dá)載體pTWIN1-EgAgB8/3,并鑒定其表達(dá)的融合蛋白主要以可溶形式存在;構(gòu)建的重組載體中融合標(biāo)簽的幾丁質(zhì)結(jié)合域（CBD）和內(nèi)含肽（intein1）分別使親和層析純化和融合標(biāo)簽自剪切一步完成。結(jié)論成功的構(gòu)建重組表達(dá)載體pTWIN1-EgAgB8/3,獲得高表達(dá)融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并經(jīng)簡(jiǎn)單后續(xù)處理即可獲得含極少任何額外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,盡可能保證了其原有的結(jié)構(gòu)和... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2013,29(02)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物Ｆｉｇ．１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＥｇＡｇＢ８／３

ＥｇＡｇＢ８／３原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定雙酶切ｐＥＡＳＹ－Ｔ１－ＥｇＡｇＢ８／３重組質(zhì)粒和ｐＴＷＩＮ１表達(dá)質(zhì)粒，并切膠回收ＥｇＡｇＢ８／３目的基因和ｐＴＷＩＮ１線性化的載體大片段，Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，定向克隆構(gòu)建ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、小量提取質(zhì)粒后，用ＰＣＲ法及ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ雙酶切ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表達(dá)質(zhì)粒均可得到２０７ｂｐ的ＤＮＡ片段，與預(yù)期產(chǎn)物一致（圖２）。圖２重組質(zhì)粒ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ及酶切鑒定結(jié)果Ｆｉｇ．２ＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙＰＣＲａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ：ＤＬ１００００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１－２：ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｄｉｇｅｓ－ｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩａｎｄＢａｍＨＩ２．４ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的表達(dá)純化１５６

２期張瑞妮等：ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３自剪切融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定將ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ＥｇＡｇＢ８／３－Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５６６感受態(tài)細(xì)胞中，接種培養(yǎng)后誘導(dǎo)４ｈ，菌液超聲離心后分別取上清和沉淀（圖３第３條泳道和第４條泳道）作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可見(jiàn)在３３ｋＤａ處出現(xiàn)明顯的普帶，說(shuō)明融合蛋白已成功表達(dá)并為可溶性蛋白，通過(guò)融合蛋白Ｎ末端融合的ＣＢＤ蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱上，并在蛋白質(zhì)成熟加工過(guò)程中自行剪切去除，獲得高純度目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３（如圖３第６、７、８泳道），圖３第５泳道為純化時(shí)超聲后上清蛋白樣品通過(guò)幾丁質(zhì)樹(shù)脂結(jié)合后流出的樣品，在３３ｋＤａ處沒(méi)有融合蛋白條帶，可見(jiàn)幾丁質(zhì)結(jié)合ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的效率幾乎為１００％。２．５ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白和目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定對(duì)表達(dá)后的融合蛋白進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定，可以看到在３０ｋＤａ處有兩條清晰的特異性條帶，一條為３３ＫＤａ的重組蛋白，另一條為降解了的蛋白片段（圖４ａ），對(duì)純化后得到ｒＥｇＡｇＢ８／３蛋白進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定，可看到８ｋＤａ處有清晰的唯一的特異性條帶（圖４ｂ）。圖３融合蛋白的表達(dá)純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析圖譜Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕ


本文編號(hào)：3439948