發(fā)布時間：2021-10-16 14:10

　　目的表達獲得較純的細粒棘球絳蟲AgB8/3重組抗原（rEgAgB8/3）。方法根據(jù)GeneBank登陸號（AF362442）下載目的基因核酸序列,利用DNAman軟件設計引物,對EgAgB8/3編碼分泌型多肽片段的核酸序列進行PCR擴增,測序鑒定其正確性后定向連入原核表達質粒pTWIN1上,并轉化至大腸桿菌ER2566,IPTG誘導表達CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后進行純化,用SDS-PAGE電泳和western blot分析鑒定融合蛋白與目的蛋白rEgAgB8/3的表達量和純度。結果成功克隆獲得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重組表達載體pTWIN1-EgAgB8/3,并鑒定其表達的融合蛋白主要以可溶形式存在;構建的重組載體中融合標簽的幾丁質結合域（CBD）和內(nèi)含肽（intein1）分別使親和層析純化和融合標簽自剪切一步完成。結論成功的構建重組表達載體pTWIN1-EgAgB8/3,獲得高表達融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并經(jīng)簡單后續(xù)處理即可獲得含極少任何額外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,盡可能保證了其原有的結構和... 

【文章來源】：中國人獸共患病學報. 2013,29(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

圖１ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ擴增產(chǎn)物Ｆｉｇ．１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＥｇＡｇＢ８／３

ＥｇＡｇＢ８／３原核表達質粒的鑒定雙酶切ｐＥＡＳＹ－Ｔ１－ＥｇＡｇＢ８／３重組質粒和ｐＴＷＩＮ１表達質粒，并切膠回收ＥｇＡｇＢ８／３目的基因和ｐＴＷＩＮ１線性化的載體大片段，Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，定向克隆構建ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表達質粒，經(jīng)轉化、培養(yǎng)、小量提取質粒后，用ＰＣＲ法及ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ雙酶切ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表達質粒均可得到２０７ｂｐ的ＤＮＡ片段，與預期產(chǎn)物一致（圖２）。圖２重組質粒ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ及酶切鑒定結果Ｆｉｇ．２ＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙＰＣＲａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ：ＤＬ１００００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１－２：ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｄｉｇｅｓ－ｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩａｎｄＢａｍＨＩ２．４ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的表達純化１５６

２期張瑞妮等：ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３自剪切融合蛋白原核表達載體的構建及表達鑒定將ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３重組質粒轉化入ＥｇＡｇＢ８／３－Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５６６感受態(tài)細胞中，接種培養(yǎng)后誘導４ｈ，菌液超聲離心后分別取上清和沉淀（圖３第３條泳道和第４條泳道）作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可見在３３ｋＤａ處出現(xiàn)明顯的普帶，說明融合蛋白已成功表達并為可溶性蛋白，通過融合蛋白Ｎ末端融合的ＣＢＤ蛋白吸附于幾丁質柱上，并在蛋白質成熟加工過程中自行剪切去除，獲得高純度目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３（如圖３第６、７、８泳道），圖３第５泳道為純化時超聲后上清蛋白樣品通過幾丁質樹脂結合后流出的樣品，在３３ｋＤａ處沒有融合蛋白條帶，可見幾丁質結合ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的效率幾乎為１００％。２．５ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白和目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定對表達后的融合蛋白進行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定，可以看到在３０ｋＤａ處有兩條清晰的特異性條帶，一條為３３ＫＤａ的重組蛋白，另一條為降解了的蛋白片段（圖４ａ），對純化后得到ｒＥｇＡｇＢ８／３蛋白進行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定，可看到８ｋＤａ處有清晰的唯一的特異性條帶（圖４ｂ）。圖３融合蛋白的表達純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析圖譜Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕ


本文編號：3439948