目的采用成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（CRISPR/Cas9）基因編輯技術(shù)構(gòu)建叉頭框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干細胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干細胞早期神經(jīng)誘導(dǎo)過程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),通過轉(zhuǎn)染2個向?qū)NA（gRNA）誘導(dǎo)人胚胎干細胞FOXG1基因的大片段敲除,經(jīng)單克隆篩選、測序分析和蛋白質(zhì)印跡分析驗證獲得FOXG1基因敲除的人胚胎干細胞;通過細胞免疫熒光染色、qRT-PCR檢測FOXG1基因敲除前后細胞在早期神經(jīng)誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵標志物配對框基因6（PAX6）、性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）和正小齒同源物2（OTX2）的表達。結(jié)果利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干細胞,細胞免疫熒光染色、qRT-PCR結(jié)果均顯示人胚胎干細胞早期神經(jīng)誘導(dǎo)過程中的關(guān)鍵標志物PAX6、SOX2和OTX2的表達并未受FOXG1缺失的影響。結(jié)論通過2個gRNA共轉(zhuǎn)染可以快捷地誘導(dǎo)人胚胎干細胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影響人胚胎干細胞的早期神經(jīng)誘導(dǎo)。 

【文章來源】：第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2020,41(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

gRNA及基因型鑒定引物在FOXG1 mRNA序列中的位置示意圖

進一步使用3對引物對誘導(dǎo)后細胞FOXG1基因表達進行了RT-PCR檢測,引物位置見圖1。引物組合P1+/P3-在gRNA敲除片段的兩側(cè),RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)前的C9細胞和對照hESC(H1細胞)中均不表達FOXG1;而神經(jīng)誘導(dǎo)后均可以檢測到FOXG1的表達,H1 細胞的PCR產(chǎn)物為550 bp,但C9細胞FOXG1的擴增片段顯著截短,PCR產(chǎn)物大小為240 bp。引物P2+和P2-均位于2條gRNA的編輯區(qū)域內(nèi),使用引物組合P1+/P2-和P2+/P3-進行RT-PCR,僅能在神經(jīng)誘導(dǎo)后的H1細胞中檢測到FOXG1的表達條帶,大小分別為500 bp和300 bp(圖 5)。結(jié)果進一步證明C9克隆發(fā)生了FOXG1基因的大片段剪切編輯。3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)FOXG1基因敲除小鼠出生后即死亡,大腦半球發(fā)育異常、體積較野生型小鼠顯著減小,尤其是腹側(cè)前腦幾乎缺失[6]。本研究借助人PSC研究FOXG1基因在體外神經(jīng)誘導(dǎo)和分化中的作用,利用改進的雙重Smad抑制誘導(dǎo)人PSC的神經(jīng)分化,該方法可以在7 d內(nèi)高度均一地將人PSC誘導(dǎo)分化為類似于發(fā)育過程中的神經(jīng)板細胞,但是結(jié)果顯示FOXG1基因敲除并沒有顯著影響SOX2、 PAX6和CTX2等基因的表達。SOX2既是PSC的標志分子,也是早期神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵基因;轉(zhuǎn)錄因子PAX6是人神經(jīng)外胚層最早表達的核心分子[10];OTX2是前中腦的標志分子。發(fā)生這種體外和體內(nèi)基因缺失后表型不吻合的可能原因是體外二維的神經(jīng)誘導(dǎo)環(huán)境無法忠實地模擬體內(nèi)三維的組織發(fā)生過程,因此有必要利用PSC的神經(jīng)類器官分化體系進一步研究FOXG1對三維條件下神經(jīng)誘導(dǎo)的影響。此外,FOXG1基因敲除是否會影響后期神經(jīng)板細胞在神經(jīng)發(fā)育前后軸和背腹軸上的區(qū)域化及神經(jīng)元的分化有待進一步研究。


本文編號：3416638