巨噬細胞、樹突狀細胞是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵部分,是抵御病原體入侵、維持機體健康穩(wěn)態(tài)的主要細胞之一。巨噬細胞是機體炎癥反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)中關(guān)鍵的效應(yīng)細胞和調(diào)節(jié)細胞;樹突狀細胞啟動并調(diào)節(jié)高度病原特應(yīng)性的適應(yīng)性免疫反應(yīng),也是產(chǎn)生免疫記憶和免疫耐受的關(guān)鍵。巨噬細胞以及樹突狀細胞與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。如腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以分泌多種細胞因子等促進腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移;Ⅱ型糖尿病脂肪組織中募集的巨噬細胞分泌炎性細胞因子,導(dǎo)致胰島素抵抗;樹突狀細胞提呈自身抗原時,激活自身反應(yīng)性淋巴細胞,導(dǎo)致機體免疫失衡,導(dǎo)致自身免疫疾病發(fā)生。干預(yù)這兩種細胞的功能,將有助于疾病的治療。本論文基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),利用陽離子脂質(zhì)輔助的PEG-b-PLGA聚合物納米顆粒（CLAN）載藥體系,制備包載CRISPR/Cas9核酸藥物,分別靶向巨噬細胞和樹突狀細胞,研究其對巨噬細胞和樹突狀細胞功能的干預(yù),以及對于相關(guān)疾病治療的效果。本論文的研究工作主要分為兩部分:1.CRISPR/Cas9基因編輯工具有望用于治療多種疾病,我們構(gòu)建了巨噬細胞特異性啟動子啟動的Cas9質(zhì)粒系統(tǒng),并且利用CLAN技術(shù)包載該質(zhì)... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 巨噬細胞和樹突狀細胞的功能與疾病發(fā)生
        1.1.1 巨噬細胞和樹突狀細胞簡介
        1.1.2 巨噬細胞和樹突狀細胞的功能
        1.1.3 巨噬細胞和樹突狀細胞與疾病的發(fā)生
    1.2 巨噬細胞和樹突狀細胞的功能干預(yù)與疾病治療
        1.2.1 抗體
        1.2.2 免疫調(diào)節(jié)劑
        1.2.3 細胞療法
    1.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
        1.3.1 基因編輯技術(shù)介紹
        1.3.2 CRISPR/Cas9的分類與應(yīng)用
        1.3.3 CRISPR/Cas9的遞送與疾病治療
    1.4 核酸納米藥物遞送系統(tǒng)
        1.4.1 核酸藥物遞送的障礙
        1.4.2 核酸納米藥物遞送系統(tǒng)的分類
        1.4.3 核酸納米藥物遞送系統(tǒng)與免疫細胞功能干預(yù)
    1.5 選題依據(jù)及主要研究內(nèi)容
    參考文獻
第二章 CLAN納米顆粒介導(dǎo)巨噬細胞特異性基因編輯的研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 細胞與動物
        2.2.3 主要藥品及試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 巨噬細胞特異性基因編輯質(zhì)粒的設(shè)計和構(gòu)建
        2.3.2 包載CRISPR/Cas9質(zhì)粒系的納米顆粒(CLAN)的制備
        2.3.3 CLAN對siRNA及CRISPR/Cas9質(zhì)粒的包封率、回收率的測定
        2.3.4 CLAN納米顆粒粒徑及表面電勢的表征
        2.3.5 CLAN納米顆粒的形態(tài)表征
        2.3.6 檢測不同細胞對CLAN_(Cy5-siRNA)攝取能力
        2.3.7 檢測不同細胞轉(zhuǎn)染CLAN_(pM458)后Cas9和EGFP的表達
        2.3.8 檢測體內(nèi)不同的免疫細胞對CLANC_(y5-siRNA)的攝取能力
        2.3.9 檢測CLAN_(pM458)在小鼠體內(nèi)單核巨噬細胞中EGFP和Cas9的表達
        2.3.10 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)對巨噬細胞Ntn1基因的敲除效率
        2.3.11 建立高脂飲食誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病(T2D)小鼠模型
        2.3.12 CLAN_(pM330/sgNtn1)針對T2D疾病模型小鼠的治療
        2.3.13 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)治療結(jié)束后Ntn1基因的敲除效率
        2.3.14 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)治療結(jié)束后脂肪組織中netrin-1的表達
        2.3.15 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)治療結(jié)束后潛在的脫靶效應(yīng)
        2.3.16 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)治療結(jié)束后IL-6和TNF-α表達
        2.3.17 檢測CLAN_(pM330/sgNtn1)治療結(jié)束后脂肪組織中巨噬細胞的浸潤
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 巨噬細胞特異性CD68啟動子啟動的CRISPR/Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.2 巨噬細胞特異性CD68啟動子啟動的CRISPR/Cas9質(zhì)粒的鑒定
        2.4.3 CLAN納米顆粒的制備及表征
        2.4.4 CLAN納米顆粒包載CRISPR/Cas9質(zhì)粒在細胞水平的轉(zhuǎn)染效果
        2.4.5 體外驗證CD68啟動子啟動的Cas9-EGFP在巨噬細胞中特異性表達
        2.4.6 體內(nèi)驗證CD68啟動子啟動的Cas9-EGFP在巨噬細胞中特異性表達
        2.4.7 CLAN_(pM330/sgNtn1)敲除Ntn1基因的效率檢測
        2.4.8 CLAN_(pM330/sgNtn1)對T2D疾病小鼠模型的治療效果
        2.4.9 CLAN_(pM330/sgNtn1)治療后細胞因子分泌、脂肪組織巨噬細胞滯留情況表征
        2.4.10 CLAN_(pM330/sgNtn1)治療后脫靶效應(yīng)評估
    2.5 本章小結(jié)
    參考文獻
第三章 CLAN納米顆粒遞送CRISPR/Cas9及抗原肽干預(yù)樹突狀細胞功能的研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 主要材料
        3.2.2 細胞和動物
        3.2.3 主要藥品及試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 靶向CD80、CD86和CD40的CRISPR/Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 體外轉(zhuǎn)錄靶向CD80、CD86以及CD40的gRNA
        3.3.3 包載CRIPSR/Cas9質(zhì)粒以及抗原肽的CLAN納米顆粒的制備及表征
        3.3.4 檢測CLAN納米顆粒遞送質(zhì)粒和抗原肽至BMDC的能力
        3.3.5 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)對BMDC共刺激分子的敲除效率
        3.3.6 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)轉(zhuǎn)染后BMDC對抗原肽的提呈
        3.3.7 小鼠CD4~+T細胞分離培養(yǎng)
        3.3.8 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)轉(zhuǎn)染后BMDC與T細胞的作用
        3.3.9 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)在體內(nèi)對共刺激分子的敲除效率
        3.3.10 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40)對體內(nèi)樹突狀細胞的編輯效率
        3.3.11 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)對T1D疾病小鼠模型的治療
        3.3.12 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治療結(jié)束后胰腺組織病理學(xué)的分析胰腺組織學(xué)分析
        3.3.13 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治療結(jié)束后小鼠T細胞亞群的變化
        3.3.14 檢測CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治療結(jié)束后細胞因子分泌
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 體外轉(zhuǎn)錄CD80 gRNA、CD86 gRNA、CD40 gRNA
        3.4.2 CLAN納米顆粒的制備和表征
        3.4.3 BMDC對包載CRISPR/Cas9和抗原肽的CLAN納米顆粒的攝取
        3.4.4 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)轉(zhuǎn)染BMDC后的基因編輯效率以及抗原的提呈
        3.4.5 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)轉(zhuǎn)染BMDC后對T細胞的抗原提呈
        3.4.6 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40)對體內(nèi)樹突狀細胞的基因編輯
        3.4.7 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)對T1D疾病小鼠模型的治療
        3.4.8 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治療后T1D小鼠抗原特異性Treg細胞的產(chǎn)生
        3.4.9 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治療后T1D小鼠炎癥細胞因子的分泌
    3.5 本章總結(jié)
    參考文獻
附錄一 主要儀器設(shè)備
附錄二 常規(guī)試劑
附錄三 常用試劑的準備
附錄四 常規(guī)實驗方法
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3411800