目的:溶酶體膜蛋白SIDT2的缺失在小鼠脂肪組織自噬和分化成熟過程中潛在機制初探。方法:本實驗通過采用Cre/loxp重組酶系統構建全身Sidt2基因敲除的小鼠模型,利用腺病毒感染3T3-L1前脂肪細胞獲得Sidt2基因剔除的3T3-L1細胞模型。借助western blot檢測小鼠脂肪組織和3T3-L1前脂肪細胞自噬通路關鍵蛋白表達情況。在發(fā)現Sidt2基因缺失小鼠脂肪組織和細胞均出現自噬途徑受阻后,進一步使用影響自噬途徑的藥物氯喹、雷帕霉素、3-MA以及免疫熒光等實驗方法更深一層探討Sidt2基因在小鼠脂肪組織自噬途徑中如何發(fā)揮作用。通過HE染色檢測小鼠脂肪組織切片改變,油紅O染色檢測Sidt2基因剔除3T3-L1前脂肪細胞誘導分化變化情況,并繼續(xù)從蛋白水平檢測脂肪細胞誘導分化過程關鍵因子的表達變化情況。進一步探討Sidt2、自噬和脂肪細胞分化三者之間的是否存在某種關系。結果:1.成功獲得Sidt2基因剔除的小鼠模型和細胞模型并在基因和蛋白水平予以檢測確定造模成功。2.蛋白水平檢測自噬途徑關鍵蛋白LC3B、P62等發(fā)現Sidt2基因剔除小鼠脂肪組織和3T3-L1細胞自噬通路受阻礙。... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學院安徽省

【文章頁數】：68 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖為野生鼠外觀

圖 2 正常野生鼠和剔除鼠脂肪組織中 Sidt2 蛋白表達情況（**為 P<0.01 vs.control,n=3 ）。1.2 Sidt2 基因剔除 3T3-L1 前脂肪細胞模型構建和鑒定利用本實驗室已有的敲除 Sidt2 基因的 AdEasy 腺病毒（實驗室?guī)煹苤苽洌└腥?3T3-L1細胞 4h 后繼續(xù)新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 48h，因所感染腺病毒帶 GFP 標簽，鏡下可觀察細胞表達綠色熒光（如圖 3 所示）。細胞培養(yǎng) 72h 后觀察細胞密度基本已達 80-90%，對細胞進行傳代，其中一半細胞用來提取 RNA，逆轉錄成 cDNA 通過 qPCR 鑒定細胞 Sidt2 基因敲除率，結果顯示基因剔除率可達 80%左右(如圖 6 所示)。剩下的一半細胞繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培液中的嘌呤霉素可繼續(xù)篩除未轉染成功的 3T3-L1前脂肪細胞。

圖 3 3T3-L1 前脂肪細胞感染 AdEasy 腺病毒敲除 Sidt2 基因后鑒定結果。圖 A-B 為 3T3-L1 前脂細胞感染腺病毒后熒光顯微鏡下可見細胞表達 GFP 綠色熒光蛋白；圖 C 為剔除 Sidt2 基因得 3T3前脂肪細胞提取細胞 RNA 逆轉錄成 cDNA 后通過 qPCR 鑒定結果（**為 P<0.01，vs.control,n=3）1.3 Sidt2 基因剔除自噬途徑關鍵蛋白表達情況1.3.1 Sidt2 基因剔除小鼠脂肪組織自噬通路關鍵蛋白表達情況提取 Sidt2 全身剔除小鼠附睪脂肪組織總蛋白后，通過 western blot 檢測自噬通路關鍵蛋白的表達情況。結果發(fā)現，與野生小鼠體內各蛋白表達量相比較，Sidt2 純合子小鼠自噬通路關鍵蛋白 P62、LC3B、ATG5、Beclin1 明顯增多，而 ATG7 又表現出相反的減少趨勢，ATG12 表達未見明顯改變（如圖 4 所示）。


本文編號：3411527