目的:溶酶體膜蛋白SIDT2的缺失在小鼠脂肪組織自噬和分化成熟過程中潛在機(jī)制初探。方法:本實(shí)驗(yàn)通過采用Cre/loxp重組酶系統(tǒng)構(gòu)建全身Sidt2基因敲除的小鼠模型,利用腺病毒感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞獲得Sidt2基因剔除的3T3-L1細(xì)胞模型。借助western blot檢測小鼠脂肪組織和3T3-L1前脂肪細(xì)胞自噬通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況。在發(fā)現(xiàn)Sidt2基因缺失小鼠脂肪組織和細(xì)胞均出現(xiàn)自噬途徑受阻后,進(jìn)一步使用影響自噬途徑的藥物氯喹、雷帕霉素、3-MA以及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法更深一層探討Sidt2基因在小鼠脂肪組織自噬途徑中如何發(fā)揮作用。通過HE染色檢測小鼠脂肪組織切片改變,油紅O染色檢測Sidt2基因剔除3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化變化情況,并繼續(xù)從蛋白水平檢測脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程關(guān)鍵因子的表達(dá)變化情況。進(jìn)一步探討Sidt2、自噬和脂肪細(xì)胞分化三者之間的是否存在某種關(guān)系。結(jié)果:1.成功獲得Sidt2基因剔除的小鼠模型和細(xì)胞模型并在基因和蛋白水平予以檢測確定造模成功。2.蛋白水平檢測自噬途徑關(guān)鍵蛋白LC3B、P62等發(fā)現(xiàn)Sidt2基因剔除小鼠脂肪組織和3T3-L1細(xì)胞自噬通路受阻礙。... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學(xué)院安徽省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖為野生鼠外觀

圖 2 正常野生鼠和剔除鼠脂肪組織中 Sidt2 蛋白表達(dá)情況（**為 P<0.01 vs.control,n=3 ）。1.2 Sidt2 基因剔除 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞模型構(gòu)建和鑒定利用本實(shí)驗(yàn)室已有的敲除 Sidt2 基因的 AdEasy 腺病毒（實(shí)驗(yàn)室?guī)煹苤苽洌└腥?3T3-L1細(xì)胞 4h 后繼續(xù)新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 48h，因所感染腺病毒帶 GFP 標(biāo)簽，鏡下可觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（如圖 3 所示）。細(xì)胞培養(yǎng) 72h 后觀察細(xì)胞密度基本已達(dá) 80-90%，對細(xì)胞進(jìn)行傳代，其中一半細(xì)胞用來提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 通過 qPCR 鑒定細(xì)胞 Sidt2 基因敲除率，結(jié)果顯示基因剔除率可達(dá) 80%左右(如圖 6 所示)。剩下的一半細(xì)胞繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培液中的嘌呤霉素可繼續(xù)篩除未轉(zhuǎn)染成功的 3T3-L1前脂肪細(xì)胞。

圖 3 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞感染 AdEasy 腺病毒敲除 Sidt2 基因后鑒定結(jié)果。圖 A-B 為 3T3-L1 前脂細(xì)胞感染腺病毒后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞表達(dá) GFP 綠色熒光蛋白；圖 C 為剔除 Sidt2 基因得 3T3前脂肪細(xì)胞提取細(xì)胞 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后通過 qPCR 鑒定結(jié)果（**為 P<0.01，vs.control,n=3）1.3 Sidt2 基因剔除自噬途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況1.3.1 Sidt2 基因剔除小鼠脂肪組織自噬通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況提取 Sidt2 全身剔除小鼠附睪脂肪組織總蛋白后，通過 western blot 檢測自噬通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生小鼠體內(nèi)各蛋白表達(dá)量相比較，Sidt2 純合子小鼠自噬通路關(guān)鍵蛋白 P62、LC3B、ATG5、Beclin1 明顯增多，而 ATG7 又表現(xiàn)出相反的減少趨勢，ATG12 表達(dá)未見明顯改變（如圖 4 所示）。


本文編號：3411527