第一部分膜融合是一種重要的生命現(xiàn)象,參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括細(xì)胞融合,囊泡轉(zhuǎn)運(yùn),細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)變化以及病毒感染。幾乎所有這些活動(dòng)都是由一類特殊的膜蛋白——膜融合蛋白（也稱為融合原）所介導(dǎo)的。廣為熟知的融合蛋白是介導(dǎo)囊泡融合的SNARE復(fù)合物,在過去二十年中其作用機(jī)制已經(jīng)得到深入揭示。另一種重要的融合事件是包膜病毒的融合,這是由病毒融合蛋白所介導(dǎo)的。病毒融合蛋白定位在病毒的包膜上,控制病毒感染的關(guān)鍵步驟——病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合。不同的融合蛋白誘導(dǎo)膜融合的物理過程基本相同,但具體機(jī)制卻大不相同。與SNARE復(fù)合物不同,病毒融合蛋白的構(gòu)象復(fù)雜得多,這也決定了其融合機(jī)制更為復(fù)雜。在本研究中,我們關(guān)注水泡型口炎病毒的融合蛋白G蛋白的跨膜區(qū)在融合中的作用機(jī)制。我們構(gòu)建了一套新的細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng),方便我們對VSVG介導(dǎo)的融合時(shí)間進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控以及定量分析。根據(jù)這套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)VSVG能夠在1-2min的時(shí)間內(nèi)迅速介導(dǎo)細(xì)胞融合。為了研究跨膜區(qū)的功能,我們將VSVG的跨膜區(qū)替換成了其他融合蛋白的跨膜區(qū)。結(jié)果顯示跨膜區(qū)的替換會(huì)顯著降低VSV G的融合效率及其介導(dǎo)的慢病毒感染效率。由于VSV G的胞... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２三種類型的病毒融合蛋白［１３】

白的Ｈｅｌａ細(xì)胞系。將這兩群細(xì)胞共培養(yǎng)約１２ｈ，利用ｐＨ?６．０的ＭＥＳ緩沖液誘導(dǎo)ｌｍｉｎ，??即可觀察到細(xì)胞－細(xì)胞融合的現(xiàn)象一一胞漿為紅色同時(shí)含有多個(gè)藍(lán)色胞核的融合細(xì)??胞（圖３），多個(gè)胞核的巨大合胞體的出現(xiàn)也提示多輪融合事件的發(fā)生。而不表達(dá)??ＶＳＶＧ的細(xì)胞在酸性條件下并不會(huì)發(fā)生融合（圖３）。??０?Ｌ??ＶＳＶＧ?ｘ’??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ??ＤＨ?Ｈｉ?Ｂｎ??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｎｏ?ｆｕｓｉｏｎ??■＋ＨＢ，個(gè)??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?＋?ＶＳＶ?Ｇ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｆｕｓｉｏｎ??圖３ＶＳＶＧ誘導(dǎo)的細(xì)胞－細(xì)胞融合。（Ａ）細(xì)胞－細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)原理圖。胞漿表達(dá)紅色熒光蛋白同??時(shí)攜帶有ＶＳＶＧ的細(xì)胞與胞核表達(dá)青色熒光蛋白的細(xì)胞在低ｐＨ的刺激下發(fā)生融合，融合細(xì)胞??含有紅色的胞漿和多個(gè)青色的胞核。（Ｂ）?ＶＳＶＧ介導(dǎo)的Ｈｅｌａ細(xì)胞融合。細(xì)胞表面沒有ＶＳＶＧ??低ｐＨ無法刺激融合事件的發(fā)生（上圖），而ＶＳＶ?Ｇ表達(dá)細(xì)胞在酸性條件下則可以誘導(dǎo)大量融??合時(shí)間的發(fā)生（下圖）。??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ．?（Ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｓｈｏｗｓ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ??ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ：?ｃｅｌｌｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ａｎｄ?ｃｙｔｏｓｏｌ?ｌｏｃａｌｉｚｅｄ?ｄｓＲｅｄ?ｆｕｓｅ

ｐａｎｅｌ）．??同時(shí)，我們利用這一系統(tǒng)對ＶＳＶ?Ｇ介導(dǎo)的融合過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)控。我們發(fā)??現(xiàn)低ｐＨ刺激ｌ－２ｍｉｎ內(nèi)即可觀察到紅色的胞漿向臨近細(xì)胞的擴(kuò)散（圖４），即發(fā)生了??細(xì)胞融合。這一時(shí)間動(dòng)態(tài)與最近報(bào)道的ＶＳＶ病毒－脂雙層半融合發(fā)生所需的２５－３０ｓ??的時(shí)間基本一致［３９］。而由于胞漿擴(kuò)散過程導(dǎo)致時(shí)間上的延遲，因此實(shí)際的融合過??程應(yīng)該發(fā)生得更為迅速，可能在數(shù)秒時(shí)間內(nèi)即可完成。??ｍｍｍ??Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）?－３０?０?３０??＿鑫＿??６０?１２０?２４０??圖４?ＶＳＶ?Ｇ蛋白介導(dǎo)細(xì)胞－細(xì)胞融合的時(shí)間軸記錄。ＶＳＶ?Ｇ介導(dǎo)的細(xì)胞融合在酸性條件刺激后??ｌ－２ｍｉｎ內(nèi)迅速發(fā)生。??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｔｈｅ?ｔｉｍｅ?ｃｏｕｒｓｅ?ｏｆ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ．?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｉｎｄｕｃｅｄ??ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ｏｃｃｕｒｒｅｄ?ｑｕｉｃｋｌｙ?ａｆｔｅｒ?ａｃｉｄｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．??我們構(gòu)建細(xì)胞－細(xì)胞融合模型對ＶＳＶ?Ｇ介導(dǎo)的融合事件進(jìn)行定量分析，并通過??實(shí)時(shí)監(jiān)控融合過程，對融合事件的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了闡釋，我們發(fā)現(xiàn)ＶＳＶＧ介導(dǎo)??的膜融合過程快速且高效。??２．跨膜區(qū)的替換不會(huì)影響ＶＳＶＧ的表達(dá)及其在質(zhì)膜的定位??多項(xiàng)研究表明，融合蛋白的跨膜區(qū)在融合過程中可作為力學(xué)元件會(huì)對脂膜產(chǎn)生??力的作用來促進(jìn)膜融合。之前的一項(xiàng)研宄指出ＶＳＶ?Ｇ的跨膜區(qū)不會(huì)影響其融合功??能Ｐ８］，而這與ＳＮＡＲＥ復(fù)合物和另外一些病毒融合蛋白的相關(guān)研究結(jié)果相悖［３４－３７］。??因此

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]亞硒酸鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 舒適,黃強(qiáng).  現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與健康研究電子雜志. 2020(02)



本文編號：3367894