背景:卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）又稱為人皰疹病毒8型,是卡波氏肉瘤（KS）的病原。KSHV感染后在體內(nèi)有潛伏感染（latent）和裂解激活（lytic）兩種狀態(tài)。潛伏相關(guān)核抗原（LANA）是維持KSHV潛伏感染的關(guān)鍵因子,在KSHV感染的細胞中持續(xù)表達。復制與轉(zhuǎn)錄激活因子（RTA）是KSHV裂解復制的“開關(guān)”分子,僅在病毒初始感染（de novo infection）和裂解復制時表達。重組信號序列結(jié)合蛋白J kappa（RBPJ）在KSHV復制調(diào)控方面呈現(xiàn)雙重效應,與LANA或RTA結(jié)合分別發(fā)揮維持潛伏感染和促進裂解復制的功能,但RBPJ維持潛伏感染和促進裂解復制功能相互轉(zhuǎn)變的機制尚不完全清楚。RTA和LANA啟動子上均有RBPJ結(jié)合元件,而我們前期研究發(fā)現(xiàn)LANA通過let-7a/RBPJ信號調(diào)控KSHV潛伏感染;RTA下調(diào)Let-7a,上調(diào)RBPJ。提示let-7a/RBPJ信號受RTA和LANA的雙重調(diào)控,并因此影響RTA和LANA自身的表達來控制KSHV潛伏和裂解復制的轉(zhuǎn)變。目的:明確RTA、LANA對let-7a/RBPJ信號共調(diào)控作用,RBPJ在RTA和LANA相互... 

【文章來源】：杭州師范大學浙江省

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

RTA可能通過NF-κB/Lin28B信號調(diào)節(jié)let-7a水平(A、B)在293t細胞中轉(zhuǎn)染RTA表達載體以空載體作為對照，培養(yǎng)48h后收集細胞，分別提取總蛋白和總RNA

圖 3 KSHV 從初始感染到潛伏建立過程中 let-7a、RBPJ 的表達水平（A-F）用 500ng/ml 多西環(huán)素（DOX）持續(xù)誘導 iSLK-219 細胞 3 天中間不換液，獲取的病毒子感染 HMEC-1 細胞 0，2，4，8，16，24 ，72h 后收獲細胞。(A)倒置熒光顯微鏡查看綠熒光的強度。（B、C、D、F）采用 qPCR 技術(shù)分別檢測 LANA、RTA、let-7a、RBPJ 的表達情況。（E）Western Blot 檢測 RBPJ 的蛋白表達水平。結(jié)果表示為：平均值±SEM。T 檢驗確定 P 值。*Р<0.05， **Р<0.01，NS：沒有顯著差異。4.3 KSHV 裂解復制時 let-7a、RBPJ 的表達水平由以上結(jié)果可知：當其從初始感染到潛伏建立過程中，RTA 的表達逐漸降低甚至消失，而 LANA 的表達量逐漸增加后趨于穩(wěn)定。而 RBPJ、let-7a 的表達水平則隨著 RTA，LANA 的變化而變化。Lan ke 實驗室證明在 KSHV 激活過程中 RTA 的表達水平呈現(xiàn)時序性變化。因而引起 RTA 與 LANA 比值的時序性波動

杭州師范大學學術(shù)論文 結(jié)果胞比例逐漸上升。采用 qPCR 技術(shù)檢測 RTA 和 LANA 的表達水平，結(jié)果顯示 RTA表達水平快速顯著增加，LANA 的表達水平也隨著誘導時間的延長有所增加（圖4A,B）。隨后我們又做了 RTA 和 LANA 的絕對定量（圖 3C,D,E）進一步確定 RTA和 LANA 的比值在 KSHV 激活過程中的動態(tài)變化，圖 C 為 RTA 和 LANA 標準曲線。由圖 D,E 可知：在 0h 即潛伏感染時 LANA 的表達量大約是 RTA 的 20 倍而在 DOX 誘導 12h 時 RTA 卻是 LANA 的 18 倍左右，72h 時最大約 30 倍，因此RTA 與 LANA 的比值是隨著 DOX 誘導時間的增加而增加的。qPCR 技術(shù)檢測了let-7a 的表達水平，提示隨著誘導時間的延長 let-7a 表達量逐漸降低（圖 F），采用 qPCR 及蛋白印跡技術(shù)檢測了 RBPJ 的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平，結(jié)果顯示隨著 DOX誘導時間的延長 RBPJ 表達量逐漸增加（圖 G,H），由以上結(jié)果可知：KSHV 激活過程中，RBPJ 隨著 RTA/LANA 比值的時序性增加而增加，let-7a 卻相反。

【參考文獻】：
碩士論文
[1]LANA通過let-7a/RBPJ信號通路抑制KSHV的裂解復制[D]. 齊燕.杭州師范大學 2018



本文編號：3353085