背景:卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）又稱(chēng)為人皰疹病毒8型,是卡波氏肉瘤（KS）的病原。KSHV感染后在體內(nèi)有潛伏感染（latent）和裂解激活（lytic）兩種狀態(tài)。潛伏相關(guān)核抗原（LANA）是維持KSHV潛伏感染的關(guān)鍵因子,在KSHV感染的細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活因子（RTA）是KSHV裂解復(fù)制的“開(kāi)關(guān)”分子,僅在病毒初始感染（de novo infection）和裂解復(fù)制時(shí)表達(dá)。重組信號(hào)序列結(jié)合蛋白J kappa（RBPJ）在KSHV復(fù)制調(diào)控方面呈現(xiàn)雙重效應(yīng),與LANA或RTA結(jié)合分別發(fā)揮維持潛伏感染和促進(jìn)裂解復(fù)制的功能,但RBPJ維持潛伏感染和促進(jìn)裂解復(fù)制功能相互轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不完全清楚。RTA和LANA啟動(dòng)子上均有RBPJ結(jié)合元件,而我們前期研究發(fā)現(xiàn)LANA通過(guò)let-7a/RBPJ信號(hào)調(diào)控KSHV潛伏感染;RTA下調(diào)Let-7a,上調(diào)RBPJ。提示let-7a/RBPJ信號(hào)受RTA和LANA的雙重調(diào)控,并因此影響RTA和LANA自身的表達(dá)來(lái)控制KSHV潛伏和裂解復(fù)制的轉(zhuǎn)變。目的:明確RTA、LANA對(duì)let-7a/RBPJ信號(hào)共調(diào)控作用,RBPJ在RTA和LANA相互... 

【文章來(lái)源】：杭州師范大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：50 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

RTA可能通過(guò)NF-κB/Lin28B信號(hào)調(diào)節(jié)let-7a水平(A、B)在293t細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RTA表達(dá)載體以空載體作為對(duì)照，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，分別提取總蛋白和總RNA

圖 3 KSHV 從初始感染到潛伏建立過(guò)程中 let-7a、RBPJ 的表達(dá)水平（A-F）用 500ng/ml 多西環(huán)素（DOX）持續(xù)誘導(dǎo) iSLK-219 細(xì)胞 3 天中間不換液，獲取的病毒子感染 HMEC-1 細(xì)胞 0，2，4，8，16，24 ，72h 后收獲細(xì)胞。(A)倒置熒光顯微鏡查看綠熒光的強(qiáng)度。（B、C、D、F）采用 qPCR 技術(shù)分別檢測(cè) LANA、RTA、let-7a、RBPJ 的表達(dá)情況。（E）Western Blot 檢測(cè) RBPJ 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表示為：平均值±SEM。T 檢驗(yàn)確定 P 值。*Р<0.05， **Р<0.01，NS：沒(méi)有顯著差異。4.3 KSHV 裂解復(fù)制時(shí) let-7a、RBPJ 的表達(dá)水平由以上結(jié)果可知：當(dāng)其從初始感染到潛伏建立過(guò)程中，RTA 的表達(dá)逐漸降低甚至消失，而 LANA 的表達(dá)量逐漸增加后趨于穩(wěn)定。而 RBPJ、let-7a 的表達(dá)水平則隨著 RTA，LANA 的變化而變化。Lan ke 實(shí)驗(yàn)室證明在 KSHV 激活過(guò)程中 RTA 的表達(dá)水平呈現(xiàn)時(shí)序性變化。因而引起 RTA 與 LANA 比值的時(shí)序性波動(dòng)

杭州師范大學(xué)學(xué)術(shù)論文 結(jié)果胞比例逐漸上升。采用 qPCR 技術(shù)檢測(cè) RTA 和 LANA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示 RTA表達(dá)水平快速顯著增加，LANA 的表達(dá)水平也隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)有所增加（圖4A,B）。隨后我們又做了 RTA 和 LANA 的絕對(duì)定量（圖 3C,D,E）進(jìn)一步確定 RTA和 LANA 的比值在 KSHV 激活過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，圖 C 為 RTA 和 LANA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由圖 D,E 可知：在 0h 即潛伏感染時(shí) LANA 的表達(dá)量大約是 RTA 的 20 倍而在 DOX 誘導(dǎo) 12h 時(shí) RTA 卻是 LANA 的 18 倍左右，72h 時(shí)最大約 30 倍，因此RTA 與 LANA 的比值是隨著 DOX 誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加的。qPCR 技術(shù)檢測(cè)了let-7a 的表達(dá)水平，提示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng) let-7a 表達(dá)量逐漸降低（圖 F），采用 qPCR 及蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)了 RBPJ 的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平，結(jié)果顯示隨著 DOX誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng) RBPJ 表達(dá)量逐漸增加（圖 G,H），由以上結(jié)果可知：KSHV 激活過(guò)程中，RBPJ 隨著 RTA/LANA 比值的時(shí)序性增加而增加，let-7a 卻相反。

【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]LANA通過(guò)let-7a/RBPJ信號(hào)通路抑制KSHV的裂解復(fù)制[D]. 齊燕.杭州師范大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3353085