多聚鳥氨酸逆轉(zhuǎn)纖連蛋白對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的抑制作用
發(fā)布時(shí)間：2021-08-05 21:36
研究背景:少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘細(xì)胞,其生物膜包繞軸突形成髓鞘,髓鞘的形成大大加快神經(jīng)信號(hào)在軸突上的傳導(dǎo),維持正常的神經(jīng)功能。面臨床上一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病往往累及到髓鞘,導(dǎo)致髓鞘的脫落和喪失,造成神經(jīng)傳導(dǎo)的障礙和喪失,最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。目前脫髓鞘疾病仍無(wú)有效的治療方案。大量的研究發(fā)現(xiàn)脫髓鞘疾病中細(xì)胞外微環(huán)境發(fā)生改變,不利于髓鞘的再生,其中包括纖連蛋白（Fibronectin,FN）的增加、聚集。纖連蛋白影響少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育,而目前對(duì)纖連蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞再生過(guò)程中的作用仍存在一些爭(zhēng)議,我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)確定纖連蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和再生過(guò)程中的作用,并尋找合適的新方法來(lái)促進(jìn)髓鞘發(fā)育和損傷再生。研究目的:本研究確定纖連蛋白對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的作用,及其影響的信號(hào)通路;在此基礎(chǔ)上,探討促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘再生的新型方法,為脫髓鞘疾病治療開(kāi)辟新的途徑。研究方法:（1）少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPCs）原代細(xì)胞培養(yǎng),經(jīng)過(guò)兩次差速貼壁方法進(jìn)行純化,獲得較高純度的OPCs。（2）利用免疫熒光技術(shù)在OPCs增殖過(guò)程中檢測(cè)NG2、Olig2、Ki67的表達(dá)情況,分析不同基質(zhì)處理...
【文章來(lái)源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁(yè)數(shù)】：115 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
圖２．少突膠質(zhì)細(xì)胞分化不同程度分形維數(shù)Ｄ值??
??性結(jié)構(gòu)，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)膜性結(jié)構(gòu)。（圖３）??Ｎｏｎ－ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ?Ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ?Ｍｙｅｌｉｎ?ｓｈｅｅｔｓ??圖３．少突膠質(zhì)細(xì)胞分化形成不同的膜性結(jié)構(gòu)??（４）?ＭＢＰ陽(yáng)性細(xì)胞定量分析，隨機(jī)選�。秱�(gè)區(qū)域，三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用??Ｉｍａｇｅ?Ｊ２Ｘ軟件進(jìn)行總的焚光強(qiáng)度（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ?Ｔｏｔａｌ?Ｃｅｌｌ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，?ＣＴＣＦ）和平??均焚光強(qiáng)度（Ｍｅａｎ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）計(jì)算；然后，隨機(jī)選取至少１０個(gè)??細(xì)胞，應(yīng)用Ｉｍａｇｅ?Ｊ２Ｘ軟件圈出整個(gè)細(xì)胞輪廓進(jìn)行面積計(jì)算。??２．?５熒光定量ＰＣＲ??２．５．１細(xì)胞ＲＮＡ提取??（１）
本實(shí)驗(yàn)混合細(xì)胞培養(yǎng)階段用ＰＤＬ對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，由于星形膠質(zhì)??細(xì)胞貼壁粘附較快，ＯＰＣｓ貼壁粘附相對(duì)較慢，以此可對(duì)ＯＰＣｓ進(jìn)行一次或多次??純化。純化后應(yīng)用免疫熒光對(duì)細(xì)胞染色，檢測(cè)ＯＰＣｓ的純度（圖１．１）。經(jīng)過(guò)第一??次純化后，ＯＰＣｓ的細(xì)胞純度（０１ｉｇ２＋／ＤＡＰｒ）為８９．９６±０．８７％，仍有較多的星形??膠質(zhì)細(xì)胞（ＧＦＡＰ＋細(xì)胞）；經(jīng)過(guò)第二次純化后，ＯＰＣｓ的純度明顯提高，細(xì)胞純??度達(dá)到９７．３０±０．１１％?（表１．１），避免了其它種類細(xì)胞的干擾，完全滿足實(shí)驗(yàn)中??對(duì)ＯＰＣｓ純度的要求。本課題試驗(yàn)中所用到的ＯＰＣｓ均經(jīng)過(guò)兩次純化后的細(xì)胞。??０１ｉｇ２?ＧＦＡＰ／ＤＡＰＩ?ＯＨｇ２／ＧＦＡＰ／ＤＡＰＩ??１１１??圖１．１差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化后ＯＰＣｓ純度。免疫焚光染色，０１ｉｇ２?（綠色，標(biāo)記ＯＰＣｓ）、??ＧＦＡＰ?（紅色，標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞）、ＤＡＰＩ?（藍(lán)色，標(biāo)記細(xì)胞核）。比例尺：１０（Ｕｕｉｉ??表１．１兩次純化ＯＰＣｓ細(xì)胞數(shù)及純度。（Ｘ?土ＳＥＭ，?ｎ＝６）???０丨ｉｇ２４細(xì)胞數(shù)?ＤＡＰＩ＋細(xì)胞數(shù)?０丨ｉｇ２７ＤＡＰＩ?＋?（％）??—次純化?２０９．?６７±１１．１４?２３８．?６７±１４．?８９?８９．?９６±０．?８７??二次純化?１７９．?００±１３．?５８?１８４．?００±１４．?１５?９
本文編號(hào)：3324499
【文章來(lái)源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
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【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
圖２．少突膠質(zhì)細(xì)胞分化不同程度分形維數(shù)Ｄ值??
??性結(jié)構(gòu)，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)膜性結(jié)構(gòu)。（圖３）??Ｎｏｎ－ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ?Ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ?Ｍｙｅｌｉｎ?ｓｈｅｅｔｓ??圖３．少突膠質(zhì)細(xì)胞分化形成不同的膜性結(jié)構(gòu)??（４）?ＭＢＰ陽(yáng)性細(xì)胞定量分析，隨機(jī)選�。秱�(gè)區(qū)域，三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用??Ｉｍａｇｅ?Ｊ２Ｘ軟件進(jìn)行總的焚光強(qiáng)度（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ?Ｔｏｔａｌ?Ｃｅｌｌ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，?ＣＴＣＦ）和平??均焚光強(qiáng)度（Ｍｅａｎ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）計(jì)算；然后，隨機(jī)選取至少１０個(gè)??細(xì)胞，應(yīng)用Ｉｍａｇｅ?Ｊ２Ｘ軟件圈出整個(gè)細(xì)胞輪廓進(jìn)行面積計(jì)算。??２．?５熒光定量ＰＣＲ??２．５．１細(xì)胞ＲＮＡ提取??（１）
本實(shí)驗(yàn)混合細(xì)胞培養(yǎng)階段用ＰＤＬ對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，由于星形膠質(zhì)??細(xì)胞貼壁粘附較快，ＯＰＣｓ貼壁粘附相對(duì)較慢，以此可對(duì)ＯＰＣｓ進(jìn)行一次或多次??純化。純化后應(yīng)用免疫熒光對(duì)細(xì)胞染色，檢測(cè)ＯＰＣｓ的純度（圖１．１）。經(jīng)過(guò)第一??次純化后，ＯＰＣｓ的細(xì)胞純度（０１ｉｇ２＋／ＤＡＰｒ）為８９．９６±０．８７％，仍有較多的星形??膠質(zhì)細(xì)胞（ＧＦＡＰ＋細(xì)胞）；經(jīng)過(guò)第二次純化后，ＯＰＣｓ的純度明顯提高，細(xì)胞純??度達(dá)到９７．３０±０．１１％?（表１．１），避免了其它種類細(xì)胞的干擾，完全滿足實(shí)驗(yàn)中??對(duì)ＯＰＣｓ純度的要求。本課題試驗(yàn)中所用到的ＯＰＣｓ均經(jīng)過(guò)兩次純化后的細(xì)胞。??０１ｉｇ２?ＧＦＡＰ／ＤＡＰＩ?ＯＨｇ２／ＧＦＡＰ／ＤＡＰＩ??１１１??圖１．１差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化后ＯＰＣｓ純度。免疫焚光染色，０１ｉｇ２?（綠色，標(biāo)記ＯＰＣｓ）、??ＧＦＡＰ?（紅色，標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞）、ＤＡＰＩ?（藍(lán)色，標(biāo)記細(xì)胞核）。比例尺：１０（Ｕｕｉｉ??表１．１兩次純化ＯＰＣｓ細(xì)胞數(shù)及純度。（Ｘ?土ＳＥＭ，?ｎ＝６）???０丨ｉｇ２４細(xì)胞數(shù)?ＤＡＰＩ＋細(xì)胞數(shù)?０丨ｉｇ２７ＤＡＰＩ?＋?（％）??—次純化?２０９．?６７±１１．１４?２３８．?６７±１４．?８９?８９．?９６±０．?８７??二次純化?１７９．?００±１３．?５８?１８４．?００±１４．?１５?９
本文編號(hào)：3324499
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