目的建立同時(shí)檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)的雙重?zé)晒舛縋CR兩步檢測(cè)方法。方法針對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的gdh基因和微小隱孢子蟲(chóng)的cowp基因分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針。優(yōu)化引物和探針濃度后,確定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,對(duì)其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)與金標(biāo)層析法進(jìn)行醫(yī)源性腹瀉樣本檢測(cè)的比較評(píng)估該方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果該方法能特異地檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng),對(duì)其它非目標(biāo)蟲(chóng)種均不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,特異性良好。對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同時(shí)定量擴(kuò)增的敏感度分別為45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線在10⁹ copies/μL～10¹ copies/μL之間線性關(guān)系良好（R²=0.99）,批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%。該方法與金標(biāo)層析法具有較好的一致性。結(jié)論建立的雙重?zé)晒舛縋CR兩步法可快速、靈敏、特異地同時(shí)檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng),具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)特異性引物(GIA-F/R)和探針(GIA-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果

微小隱孢子蟲(chóng)特異性引物(CRY-F/R)和探針(CRY-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)2.2引物和探針濃度優(yōu)化的結(jié)果,最終確定雙重FQ-PCR體系,體系組分包括:Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL、GIA-F(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-R(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-F(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-R(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-P(10 μmol/L) 0.6 μL、CRY-P(10 μmol/L) 0.6 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、兩蟲(chóng)DNA模板各2 μL,DEPC H2O補(bǔ)足體積至20 μL。用雙重FQ-PCR體系檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)樣本的結(jié)果見(jiàn)圖3,結(jié)果表明該體系能同時(shí)檢測(cè)兩蟲(chóng)或任意一種蟲(chóng)種。2.4 雙重FQ-PCR體系的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]實(shí)驗(yàn)用牛、羊賈第蟲(chóng)與隱孢子蟲(chóng)多重PCR方法的建立與應(yīng)用[D]. 高宇航.吉林大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3316201