本文關(guān)鍵詞：突變Y141D恢復(fù)唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的研究及其活性中心氫鍵鏈的作用分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：唾液酸是九碳鏈帶有負(fù)電荷的α酮酸唾液酸,唾液酸參與多種生理和病理過程,例如細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)菌和病毒感染以及癌癥轉(zhuǎn)移等。唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化了唾液酸從胞嘧啶核苷酸(CMP-Sia)轉(zhuǎn)向受體,是生理和病理中重要唾液酸及其相關(guān)分子的合成中的關(guān)鍵酶。由細(xì)菌中得到的唾液酸轉(zhuǎn)移酶由于其靈活的底物特異性以及在大腸桿菌中的高效的表達(dá)被廣泛用于合成各種各樣的包含唾液酸的結(jié)構(gòu)。唾液酸轉(zhuǎn)移酶GT80(Pm0106)在保守的DDG模體中141位包含一個(gè)自然突變DY,這個(gè)突變同樣存在GT52和所有GT80家族中,而且證明是沒有活性的。除此之外,一條位于Pm0106活性中心的氫鍵鏈(Asp141-Asn109-Asp33)的結(jié)構(gòu)被證明在四中GT80唾液酸家族都是保守的。為探究141位突變以及氫鍵鏈對(duì)Pm0106酶活性的作用,分別設(shè)計(jì)了Pm0106突變株Y141D、M144D141D、D141N、D141N-N109D、D141N-N109D-D33N、N109A141D、D33A141D以及D33L141D。以pET-15b為載體,NdeI和Xho I為酶切位點(diǎn),通過雙酶切建立重組質(zhì)粒。通過突變PCR得到各個(gè)突變株,轉(zhuǎn)化E.Coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生分別產(chǎn)生各個(gè)突變株蛋白,用SDS-PAGE分析,檢測(cè)蛋白濃度。建立高效液相色譜法檢測(cè)各個(gè)突變株酶反應(yīng)活性,質(zhì)譜檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物,通過建立不同PH反應(yīng)體系,HPLC分析各個(gè)產(chǎn)物峰,得到最適合反應(yīng)的pH。用薄層層析技術(shù)檢測(cè)Y141D,N109A141D以及D33A141D經(jīng)過45℃、50℃處理30min后酶反應(yīng)活性,比較各個(gè)突變株的穩(wěn)定性以及不同構(gòu)象的底物對(duì)反應(yīng)的影響。分析Pm0106酶活反應(yīng)分別得出Y141D 1/80,M144D141D1/80,N109A141D1/80時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物與剩余底物之間的比例較合適,D141N,D33A141D,D33L141D以一倍濃度時(shí)反應(yīng)較合適,而D141N-N109D,D141N-N109D-D33N反應(yīng)活性較低幾乎檢測(cè)不到反應(yīng)。通過HPLC檢測(cè),計(jì)算產(chǎn)物峰與原料峰的比例,在緩沖液為pH達(dá)8.0時(shí)反應(yīng)程度達(dá)到最大值,由此推測(cè)此反應(yīng)緩沖液的最適pH為8.0。通過薄層層析可知無(wú)論是以aLac還是β-Lac為受體,野生型Pm0160都沒有活性,而突變株Y141D,M144D141D,N109A141D,D33A141D,D33L141D以及對(duì)照PmST1都有較好的反應(yīng)活性,突變株D141N,D141N-N109D,D141N-N109D-D33N沒有反應(yīng)活性。在經(jīng)過45℃處理30min后Y141D,N109A141D以及D33A141D的活性都減小,而50℃處理30min后Y141D保留很小的活性,N109A141D和D33A141D的活性喪失。本研究表明Pm0106唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的最適pH為8.0其DDG模體中141位天冬氨酸作為廣義堿,是維持唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性必須的,由141位天冬氨酸以及鄰近的109位天冬酰胺形成的氫鍵對(duì)于維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有不可缺少的作用,而33位天冬氨酸和39位丙氨酸之間位于的螺旋在調(diào)節(jié)酶活性方面也起了一定作用。
【關(guān)鍵詞】：唾液酸轉(zhuǎn)移酶 Pm0106 氫鍵鏈 廣義堿 高效液相色譜法
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1.前言12-32
• 1.1 唾液酸及其研究意義12-14
• 1.1.1 唾液酸的生理功能12-14
• 1.1.1.1 唾液酸的抗腫瘤作用12-13
• 1.1.1.2 唾液酸抗老年性癡呆的作用13
• 1.1.1.3 唾液酸的抗病毒作用13-14
• 1.2 糖基轉(zhuǎn)移酶14-18
• 1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶的分類14-16
• 1.2.2 多糖和糖基轉(zhuǎn)移酶的功能16-18
• 1.2.2.1 植物中的分布及作用16
• 1.2.2.2 細(xì)菌中的分布及作用16-17
• 1.2.2.3 哺乳動(dòng)物中的分布及作用17-18
• 1.3 唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其分類18-22
• 1.3.1 唾液酸轉(zhuǎn)移酶18
• 1.3.2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的分類18-21
• 1.3.2.1 PmsT20-21
• 1.3.2.2 Pm010621
• 1.3.3 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)機(jī)理21-22
• 1.4 模體及其分類22-23
• 1.4.1 模體22
• 1.4.2 常見模體的分類：22-23
• 1.5 廣義堿23-24
• 1.5.1 酸堿的定義23-24
• 1.6 氫鍵鏈24-26
• 1.6.0 氫鍵24
• 1.6.1 氫鍵的形成條件24
• 1.6.2 氫鍵的飽和性和方向性24-25
• 1.6.3 氫鍵的存在對(duì)物質(zhì)的某些性質(zhì)的影響25-26
• 1.6.4 氫鍵鏈及其作用26
• 1.7 高效液相色譜法及其的檢測(cè)原理26
• 1.8 飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI-TOF)的原理及操作流程26-28
• 1.8.1 MALDI-TOF-MS的基本原理26-27
• 1.8.2 MALDI-TOF-MS的關(guān)鍵因素及解離模式27
• 1.8.3 MALDI-TOF-MS中樣品的測(cè)量方法及點(diǎn)靶方法27
• 1.8.4 MALDI-TOF-MS的操作過程及其注意事項(xiàng)27-28
• 1.9 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀28-30
• 1.10研究目的和意義30-32
• 2 材料與方法32-52
• 2.1 材料32-38
• 2.1.1 Pm0106基因32
• 2.1.2 載體來(lái)源32
• 2.1.3 感受態(tài)細(xì)胞32
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材32-34
• 2.1.4.1 主要試劑32-33
• 2.1.4.2 實(shí)驗(yàn)儀器33-34
• 2.1.5 主要試劑的配制34-38
• 2.1.5.1 培養(yǎng)基的配制34-35
• 2.1.5.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液的配制35
• 2.1.5.3 蛋白電泳相關(guān)溶液的配制35-36
• 2.1.5.4 蛋白的表達(dá)純化相關(guān)溶液的配制36-37
• 2.1.5.5 酶促反應(yīng)緩沖液及溶液的配制37
• 2.1.5.6 薄層色譜展開劑的配制37-38
• 2.1.5.7 薄層色譜顯色劑的配制38
• 2.1.5.8 高效液相色譜流動(dòng)相的配制38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法38-52
• 2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建38-41
• 2.2.1.1 野生型 Pm0106 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建38
• 2.2.1.2 引物的序列及合成38
• 2.2.1.3 載體的選擇38-39
• 2.2.1.4 PCR 體系（50μL）如下39-40
• 2.2.1.5 PCR 的程序40
• 2.2.1.6 0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收 PCR 產(chǎn)物40
• 2.2.1.7 酶切40-41
• 2.2.1.8 回收產(chǎn)物連接41
• 2.2.1.9 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化41
• 2.2.1.10 重組質(zhì)粒的測(cè)序檢測(cè)41
• 2.2.2 取測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：41-43
• 2.2.3 Pm0106突變株Y141D、M144D141D、D141N、D141N-N109D、D141N-N109D-D33N、N109A141D、D33A141D、D33L141D蛋白的表達(dá)與純化43-48
• 2.2.4 建立酶反應(yīng)體系48-52
• 3 結(jié)果分析52-62
• 3.1 以pET15b為載體的目的基因的克隆及其突變的構(gòu)建結(jié)果52-53
• 3.1.1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果52
• 3.1.2 Pm0106突變株的突變結(jié)果52-53
• 3.2 蛋白的表達(dá)與純化及濃度測(cè)定結(jié)果53-55
• 3.2.1 Pm0106各個(gè)突變株的蛋白表達(dá)53
• 3.2.2 蛋白濃度的測(cè)定53-55
• 3.3 酶活性反應(yīng)結(jié)果55-62
• 3.3.1 高效液相色譜檢測(cè)各個(gè)突變株反應(yīng)結(jié)果55-58
• 3.3.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)突變株Y141D酶活反應(yīng)產(chǎn)物及原料結(jié)果58
• 3.3.3 HPLC檢測(cè)不同PH對(duì)酶活反應(yīng)影響的結(jié)果58-60
• 3.3.4 HPLC檢測(cè) 45℃處理不同時(shí)間后Y141D（A），N109A141D(B)，D33L141D的反應(yīng)結(jié)果60
• 3.3.5 薄層層析技術(shù)檢測(cè)個(gè)突變株酶活性的結(jié)果60-62
• 4.討論62-65
• 4.1 高效液相色譜法檢測(cè)唾液酸轉(zhuǎn)移酶Pm0106各個(gè)突變株參與反應(yīng)活性的必要性62
• 4.2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶Pm0106各個(gè)突變株參與反應(yīng)的必須條件及合適的酶濃度62-63
• 4.3 Y141D突變株酶活反應(yīng)在不同PH下的影響63-64
• 4.4 底物和溫度對(duì)突變株反應(yīng)的影響64-65
• 5.結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況72

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2 盧大用,張明堅(jiān),梁罡,胥彬;高壓液相層析法研究正常鼠與荷瘤鼠血清中唾液酸含量差異及幾種藥物的影響[J];科學(xué)通報(bào);1994年10期

3 田小蘭,王家，

本文編號(hào)：331489