目的構(gòu)建一種具有同嗜性和異嗜性細(xì)胞粘附功能的重組融合蛋白FN/CDH,驗(yàn)證其對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cell,hMSCs）的促粘附、成骨效能。方法以纖維連接蛋白（fibronectin,FN）和鈣粘附蛋白11（CDH11）作為前體分子,通過生物信息學(xué)分析了解其結(jié)構(gòu)序列與功能基團(tuán)。采用"同源模建"作為分子模擬策略確定FN和CDH11功能片段的接合方式。常規(guī)PCR擴(kuò)增FNⅢ7-10和CDH11 EC1-2基因片段后應(yīng)用重疊延伸PCR（splice-overextension PCR,SOE-PCR）進(jìn)行基因拼接。將融合基因插入原核表達(dá)載體pET-22b構(gòu)建重組載體,重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rsoetta-gami（DE3）,實(shí)現(xiàn)rFN/CDH的誘導(dǎo)表達(dá),蛋白純化。免疫印跡確定融合蛋白種屬,離心促粘附實(shí)驗(yàn)和成骨誘導(dǎo)驗(yàn)證rFN/CDH體外生物活性。結(jié)果成功構(gòu)建了pET22b-FNⅢ7-10/CDH11 EC1-2融合基因原核表達(dá)載體,獲得了rFN/CDH的可溶性表達(dá),純化后rFN/CDH的純度達(dá)到96%。初步驗(yàn)證了各個(gè)融合蛋白表達(dá)屬性的準(zhǔn)確性,證實(shí)rFN... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2013,35(23)北大核心CSCD

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rFN/CDH融合蛋白的免疫印跡分析

，此濃度下rFN/CDH對(duì)MC3T3-E1的吸附作用較單獨(dú)FN或CDH作用高出40%和192%(P＜0．05);rFN/CDH具有良好的促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附的生物活性。見圖4、5。40003500300025002000150010005000510152025303540蛋白濃度（μg/mL）aa粘附效能（/wel）CDH11EC1螄2FNⅢ7螄10rFN/CDHa:P＜0．05，與CDH11EC1-2和FNⅢ7-10比較圖4rFN/CDH促進(jìn)MC3T3-E1粘附效能-濃度曲線ABCDA:Hoechst標(biāo)記的MC3T3-E1在PBS空白對(duì)照;B:CDH陽性對(duì)照(5μg/mL);C:FN陽性對(duì)照(5μg/mL);D:rFN/CDH實(shí)驗(yàn)組(5μg/mL)圖5倒置熒光顯微鏡下觀察rFN/CDH的促粘附活性(×200)2．4rFN/CDH融合蛋白的促成骨作用2．4．1rFN/CDH融合蛋白影響hMSCs成骨誘導(dǎo)后ALT酶活力ALP酶活力在hMSCs誘導(dǎo)10d后即有變化。在rFN/CDH(5μg/mL)處理的TCPS表面，ALP酶活力最高為14．46±0．46，分別較CDH陽性對(duì)照組(9．09±0．12)和FN陽性對(duì)照組(10．64±0．37)增加59%和34%(P＜0．05)。提示rFN/CDH較CDH和FN具有更好的促進(jìn)早期發(fā)生成骨分化的作用。2．4．2rFN/CDH融合蛋白影響hMSCs成骨誘導(dǎo)后OCN基因表達(dá)在rFN/CDH(5μg/mL)處理的TCPS表面，OCNmＲNA表達(dá)水平是CDH和FN陽性對(duì)照組的1．69倍和2．27倍(P＜0．05)。提示rFN/CDH可更好地促進(jìn)和啟動(dòng)hMSCs成骨相關(guān)基因OCN的表達(dá)上調(diào)，rFN/CDH具有良好的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的生物活性，用rFN/CDH涂層的TCPS表面對(duì)干細(xì)胞朝成骨方向分化具有顯著影響。3討論骨種子細(xì)胞在支架材料界面的高效粘附和靶向分化是骨修復(fù)性能的關(guān)鍵，但目前采用的多種界面改造手段由于所選擇的靶分子作用單一、活性有限，修飾方2539第35卷第23期2013年12月15日第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)JThirdMilMedUnivVol．35，No．23Dec．152013

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]成骨細(xì)胞特異性鈣黏蛋白涂布脫鈣骨基質(zhì)材料對(duì)BMSCs黏附及成骨分化能力的影響[J]. 向強(qiáng),鄧聰穎,張遠(yuǎn),張超,周躍.  中國(guó)修復(fù)重建外科雜志. 2009(05)
[2]Cad-Ⅱ基因轉(zhuǎn)染的hMSCs在異種骨基質(zhì)材料上的粘附和增殖研究[J]. 向強(qiáng),鄧聰穎,陳慶海,郭國(guó)寧,張遠(yuǎn),鄭文杰,周躍.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(05)
[3]Cad-Ⅱ基因轉(zhuǎn)染的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植術(shù)后的表達(dá)研究[J]. 向強(qiáng),鄧聰穎,鄭文杰,郭國(guó)寧,張遠(yuǎn),張超,周躍.  中國(guó)矯形外科雜志. 2009(01)



本文編號(hào)：3311235