目的構建一種具有同嗜性和異嗜性細胞粘附功能的重組融合蛋白FN/CDH,驗證其對人骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cell,hMSCs）的促粘附、成骨效能。方法以纖維連接蛋白（fibronectin,FN）和鈣粘附蛋白11（CDH11）作為前體分子,通過生物信息學分析了解其結構序列與功能基團。采用"同源模建"作為分子模擬策略確定FN和CDH11功能片段的接合方式。常規(guī)PCR擴增FNⅢ7-10和CDH11 EC1-2基因片段后應用重疊延伸PCR（splice-overextension PCR,SOE-PCR）進行基因拼接。將融合基因插入原核表達載體pET-22b構建重組載體,重組載體轉化表達菌株Rsoetta-gami（DE3）,實現(xiàn)rFN/CDH的誘導表達,蛋白純化。免疫印跡確定融合蛋白種屬,離心促粘附實驗和成骨誘導驗證rFN/CDH體外生物活性。結果成功構建了pET22b-FNⅢ7-10/CDH11 EC1-2融合基因原核表達載體,獲得了rFN/CDH的可溶性表達,純化后rFN/CDH的純度達到96%。初步驗證了各個融合蛋白表達屬性的準確性,證實rFN... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學學報. 2013,35(23)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

rFN/CDH融合蛋白的免疫印跡分析

，此濃度下rFN/CDH對MC3T3-E1的吸附作用較單獨FN或CDH作用高出40%和192%(P＜0．05);rFN/CDH具有良好的促進成骨細胞粘附的生物活性。見圖4、5。40003500300025002000150010005000510152025303540蛋白濃度（μg/mL）aa粘附效能（/wel）CDH11EC1螄2FNⅢ7螄10rFN/CDHa:P＜0．05，與CDH11EC1-2和FNⅢ7-10比較圖4rFN/CDH促進MC3T3-E1粘附效能-濃度曲線ABCDA:Hoechst標記的MC3T3-E1在PBS空白對照;B:CDH陽性對照(5μg/mL);C:FN陽性對照(5μg/mL);D:rFN/CDH實驗組(5μg/mL)圖5倒置熒光顯微鏡下觀察rFN/CDH的促粘附活性(×200)2．4rFN/CDH融合蛋白的促成骨作用2．4．1rFN/CDH融合蛋白影響hMSCs成骨誘導后ALT酶活力ALP酶活力在hMSCs誘導10d后即有變化。在rFN/CDH(5μg/mL)處理的TCPS表面，ALP酶活力最高為14．46±0．46，分別較CDH陽性對照組(9．09±0．12)和FN陽性對照組(10．64±0．37)增加59%和34%(P＜0．05)。提示rFN/CDH較CDH和FN具有更好的促進早期發(fā)生成骨分化的作用。2．4．2rFN/CDH融合蛋白影響hMSCs成骨誘導后OCN基因表達在rFN/CDH(5μg/mL)處理的TCPS表面，OCNmＲNA表達水平是CDH和FN陽性對照組的1．69倍和2．27倍(P＜0．05)。提示rFN/CDH可更好地促進和啟動hMSCs成骨相關基因OCN的表達上調(diào)，rFN/CDH具有良好的促進細胞成骨分化的生物活性，用rFN/CDH涂層的TCPS表面對干細胞朝成骨方向分化具有顯著影響。3討論骨種子細胞在支架材料界面的高效粘附和靶向分化是骨修復性能的關鍵，但目前采用的多種界面改造手段由于所選擇的靶分子作用單一、活性有限，修飾方2539第35卷第23期2013年12月15日第三軍醫(yī)大學學報JThirdMilMedUnivVol．35，No．23Dec．152013

【參考文獻】：
期刊論文
[1]成骨細胞特異性鈣黏蛋白涂布脫鈣骨基質材料對BMSCs黏附及成骨分化能力的影響[J]. 向強,鄧聰穎,張遠,張超,周躍.  中國修復重建外科雜志. 2009(05)
[2]Cad-Ⅱ基因轉染的hMSCs在異種骨基質材料上的粘附和增殖研究[J]. 向強,鄧聰穎,陳慶海,郭國寧,張遠,鄭文杰,周躍.  第三軍醫(yī)大學學報. 2009(05)
[3]Cad-Ⅱ基因轉染的兔骨髓間充質干細胞自體移植術后的表達研究[J]. 向強,鄧聰穎,鄭文杰,郭國寧,張遠,張超,周躍.  中國矯形外科雜志. 2009(01)



本文編號：3311235