本文關(guān)鍵詞：假結(jié)核耶爾森氏菌三型分泌系統(tǒng)相互作用蛋白篩選及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：三型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system,T3SS)是革蘭氏陰性致病菌重要的毒力分泌系統(tǒng)。耶爾森氏菌T3SS由pYV或者pCD毒力質(zhì)粒編碼,通過針狀注射體結(jié)構(gòu)將毒力效應因子(Yops蛋白)分泌至宿主細胞內(nèi),達到致病目的。耶爾森氏菌Ysc-Yop T3SS裝置的組裝和Yops蛋白的分泌過程非常復雜,研究蛋白之間的相互作用,對深入了解裝置組裝過程,完善Yops分泌機制具有重要意義。本研究以假結(jié)核耶爾森氏菌為研究對象,采用細菌雙雜交對pYV毒力質(zhì)粒編碼的T3SS相關(guān)蛋白進行全面篩選,并對篩選得到的相互作用蛋白進行系統(tǒng)分析。通過文獻調(diào)研,選擇本研究中新發(fā)現(xiàn)的可能對T3SS分泌過程有重要意義的相互作用蛋白進行深入研究,進一步完善對T3SS裝置組裝與Yops蛋白分泌過程的了解。論文主要包括以下三方面的內(nèi)容:1.pYV毒力質(zhì)粒上T3SS相互作用蛋白的篩選:通過細菌雙雜交藍白斑法初篩及β半乳糖苷酶活性測定復篩,共篩選到43對相互作用蛋白,其中22對已經(jīng)有文獻報道。21對尚未有文獻報道的相互作用蛋白有12對為自身相互作用蛋白,說明這些蛋白可能以多聚體的形式發(fā)揮作用。結(jié)合文獻報道,發(fā)現(xiàn)YscQ和YscO是T3SS正常發(fā)揮生理功能不可或缺的,但具體作用機制并不清楚,YopH與YopM的分泌過程也并不清楚,最終選擇YopH-YscQ和YopM-YscO作為研究對象,探討YscQ,YscO分別在YopH,YopM分泌過程是否發(fā)揮作用。2.YopH-YscQ和YopM-YscO相互作用驗證:通過體外Pull-down確定YopH-YscQ、YopM-YscO存在相互作用;通過對YopH、YscQ、YopM、YscO蛋白結(jié)構(gòu)進行分析,構(gòu)建不同的截短克隆,利用細菌雙雜交尋找作用區(qū)域。最終確定YopH N端對分泌轉(zhuǎn)運起關(guān)鍵作用的1-140aa與YscQ 218aa-C具有相互作用,而yscQ編碼全長YscQ及YscQc,YscQc與YscQ218aa-C序列一致,推測全長YscQ的218aa-C區(qū)域與YscQc在YopH的分泌轉(zhuǎn)運過程可能發(fā)揮作用;而YopM N端與分泌轉(zhuǎn)運相關(guān)的1-100aa與YscO具有相互作用,但YscO上的作用區(qū)域未能確定,YopM與YscO的相互作用可能依賴于YscO結(jié)構(gòu)的完整性。3.YscQ和YscQc功能分析:體外Pull-down驗證YscQc與YopH存在相互作用,YscQ、YscQc是T3SS發(fā)揮功能必需。通過尋找YscQc與YopH相互作用位點及對YopH分泌的影響,本研究首次發(fā)現(xiàn)YscQ和YscQc過表達對Yops分泌具有反饋抑制作用,并且這種反饋抑制可通過lcrQ的缺失得以解除,這為進一步研究YscQ/YscQc對T3SS的調(diào)控機制及LcrQ的分泌機制奠定了基礎。
【關(guān)鍵詞】：耶爾森氏菌 三型分泌系統(tǒng) 蛋白-蛋白相互作用 YscQ YopH YopM
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(武漢病毒研究所)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-7
• SUMMARY7-12
• 第一章 引言12-30
• 1.1 耶爾森氏菌簡介12
• 1.2 耶爾森氏菌三型分泌系統(tǒng)簡介12-18
• 1.2.1 細菌分泌系統(tǒng)簡介12-14
• 1.2.2 耶爾森氏菌T3SS14-15
• 1.2.3 耶爾森氏菌T3SS結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2.4 耶爾森氏菌T3SS功能16-18
• 1.3 耶爾森氏菌T3SS調(diào)控18-22
• 1.3.1 pYV毒力質(zhì)粒編碼的蛋白對T3SS的調(diào)控18-21
• 1.3.2 染色體上編碼的蛋白對T3SS的調(diào)控21-22
• 1.3.3 環(huán)境因素對T3SS的調(diào)控22
• 1.4 耶爾森氏菌T3SS蛋白分泌機制研究進展22-26
• 1.5 耶爾森氏菌T3SS相互作用蛋白研究進展26-29
• 1.6 本研究的目的和意義29
• 1.7 本研究的主要內(nèi)容29-30
• 第二章 pYV毒力質(zhì)粒上相互作用蛋白的篩選30-40
• 2.1 引言30
• 2.2 材料與方法30-33
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒30-31
• 2.2.2 引物信息31
• 2.2.3 pYV毒力質(zhì)粒上基因細菌雙雜交克隆庫的構(gòu)建31
• 2.2.4 細菌雙雜交篩選相互作用蛋白31-32
• 2.2.5 β半乳糖苷酶活性測定對相互作用蛋白的復篩32
• 2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析32-33
• 2.3 實驗結(jié)果33-39
• 2.3.1 pYV毒力質(zhì)粒相互作用蛋白初篩33-35
• 2.3.2 pYV毒力質(zhì)粒相互作用蛋白復篩35-39
• 2.4 討論39-40
• 第三章 Ysc Q/YopH，Ysc O/YopM相互作用機制初步研究40-53
• 3.1 引言40
• 3.2 材料與方法40-46
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒40-43
• 3.2.2 引物信息43
• 3.2.3 YscQ和YopH相互作用體外驗證43-45
• 3.2.4 YscO和YopM相互作用體外驗證45
• 3.2.5 yscO、yopM、yscQ、yopH細菌雙雜交截短克隆的構(gòu)建45-46
• 3.2.6 細菌雙雜交尋找YscO/YopM、YscQ/YopH相互作用區(qū)域46
• 3.3 實驗結(jié)果46-51
• 3.3.1 相互作用體外驗證46-48
• 3.3.2 相互作用區(qū)域?qū)ふ?/span>48-51
• 3.4 討論51-53
• 第四章 Ysc Q、YscQc功能分析53-65
• 4.1 引言53
• 4.2 材料與方法53-58
• 4.2.1 菌株和質(zhì)粒53-54
• 4.2.2 引物信息54
• 4.2.3 YscQc與YopH相互作用驗證54-55
• 4.2.4 yscQ缺失突變體的構(gòu)建55-57
• 4.2.5 ΔyscQ回復菌株的構(gòu)建57
• 4.2.6 Yops蛋白提取57-58
• 4.2.7 Western-Blotting58
• 4.3 實驗結(jié)果58-63
• 4.3.1 YscQc和YopH相互作用的體外驗證58-59
• 4.3.2 ΔyscQ突變體的構(gòu)建59-60
• 4.3.3 ΔyscQ突變體回復表型分析60-61
• 4.3.4 LcrQ參與YscQ，，YscQc對T3SS的調(diào)控作用61-63
• 4.4 討論63-65
• 第五章 總結(jié)和展望65-68
• 參考文獻68-75
• 附錄 引物信息75-77
• 作者簡歷77

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