目的建立一種基于重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（RAA）的廣州管圓線蟲核酸檢測方法。方法選擇廣州管圓線蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）基因序列作為靶基因序列,設(shè)計、合成并篩選出特異性最強(qiáng)的引物和探針,構(gòu)建用于廣州管圓線蟲核酸檢測的基礎(chǔ)及熒光RAA檢測方法。分別以含檢測靶基因片段序列的不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒以及不同濃度廣州管圓線蟲基因組DNA為模板進(jìn)行焚光RAA擴(kuò)增,評價其檢測敏感性;分別以廣州管圓線蟲、曼氏血吸蟲、似蚓蛔線蟲、華支睪吸蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲及小管福壽螺和藁桿雙臍螺螺體基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,評價其檢測特異性。結(jié)果成功建立了用于廣州管圓線蟲核酸檢測的熒光RAA法,該方法可在37℃20min內(nèi)對廣州管圓線蟲特異性DNA片段實現(xiàn)實時擴(kuò)增。以含靶基因片段序列的不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒和不同濃度廣州管圓線蟲基因組DNA為模板時,該法最低檢出限分別為10拷貝/μL重組質(zhì)粒和100 pg/μL基因組DNA;以曼氏血吸蟲、似蚓蛔線蟲、華支睪吸蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲及小管福壽螺和藁桿雙臍螺螺體基因組DNA為模板,檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一種可用于廣州管圓線蟲核酸檢... 

【文章來源】：中國血吸蟲病防治雜志. 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

以廣州管圓線蟲基因組DNA為模板的熒光注：樣本1

擴(kuò)增。3.2以不同濃度廣州管圓線蟲基因組DNA為模板隨著基因組DNA濃度的降低，熒光RAA信號起峰時間逐漸延長；當(dāng)廣州管圓線蟲基因組DNA濃度稀釋至100pg/μL時，10min內(nèi)仍可出現(xiàn)陽性擴(kuò)增（圖4），表明檢測靈敏度可達(dá)100pg/μL。注：樣本1、2均為廣州管圓線蟲基因組DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA圖2以廣州管圓線蟲基因組DNA為模板的熒光RAA擴(kuò)增結(jié)果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測結(jié)果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測結(jié)果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4熒光RAA法檢測特異性廣州管圓線蟲III期幼蟲基因組DNA在5min內(nèi)即可出現(xiàn)明顯陽性擴(kuò)增，而曼氏血吸蟲成蟲、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲成蟲、細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲、十二指腸鉤口線蟲鉤蚴以及藁桿雙臍螺、小管福壽螺螺體組織基因組DNA均無熒光值出現(xiàn)（圖5），表明熒光RAA法檢測廣州管圓線蟲具有良好特異性。圖5熒光RAA法檢測特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論病原學(xué)技術(shù)依然是用于中間宿主和轉(zhuǎn)續(xù)宿主體內(nèi)廣州管圓線蟲幼蟲檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用方法包括螺肺檢法、人工消化法、勻漿法等［9］。螺肺檢法和人工消化法對現(xiàn)場檢測設(shè)備及環(huán)境條件要求低，但前者檢出率較低，同時取螺肺過程也有一定操作難度；而后者操作過程多、檢測耗時較長，故容易發(fā)生漏

中國血吸蟲病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4內(nèi)即可出現(xiàn)陽性擴(kuò)增。3.2以不同濃度廣州管圓線蟲基因組DNA為模板隨著基因組DNA濃度的降低，熒光RAA信號起峰時間逐漸延長；當(dāng)廣州管圓線蟲基因組DNA濃度稀釋至100pg/μL時，10min內(nèi)仍可出現(xiàn)陽性擴(kuò)增（圖4），表明檢測靈敏度可達(dá)100pg/μL。注：樣本1、2均為廣州管圓線蟲基因組DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA圖2以廣州管圓線蟲基因組DNA為模板的熒光RAA擴(kuò)增結(jié)果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測結(jié)果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測結(jié)果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4熒光RAA法檢測特異性廣州管圓線蟲III期幼蟲基因組DNA在5min內(nèi)即可出現(xiàn)明顯陽性擴(kuò)增，而曼氏血吸蟲成蟲、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲成蟲、細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲、十二指腸鉤口線蟲鉤蚴以及藁桿雙臍螺、小管福壽螺螺體組織基因組DNA均無熒光值出現(xiàn)（圖5），表明熒光RAA法檢測廣州管圓線蟲具有良好特異性。圖5熒光RAA法檢測特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論病原學(xué)技術(shù)依然是用于中間宿主和轉(zhuǎn)續(xù)宿主體內(nèi)廣州管圓線蟲幼蟲檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用方法包括螺肺檢法、人工消化法、勻漿法等［9］。螺肺檢法和人工消化法對現(xiàn)場檢測設(shè)備及環(huán)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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