第一部分:siRNA介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞SOCS3基因沉默及沉默效率驗(yàn)證目的:構(gòu)建小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法,并制備siRNA介導(dǎo)的SOCS3基因沉默樹突狀細(xì)胞。方法:（1）采用Lutz法在rmGM-CSF和rmIL-4共同刺激下從小鼠骨髓前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠BMDC,并從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面分子兩方面對誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMDC進(jìn)行鑒定。（2）設(shè)計并合成了 3條靶向SOCS3基因的siRNA干擾序列,定向克隆到慢病毒表達(dá)載體GV248,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BMDC,收集轉(zhuǎn)染后48h的各組DC細(xì)胞,通過Western blot及qRT-PCR分別在蛋白及基因水平驗(yàn)證其沉默效率,篩選沉默效率最佳的siRNA干擾序列。（3）通過Annexin V-FITC熒光標(biāo)記法和臺盼藍(lán)染色法檢測siRNA轉(zhuǎn)染對DC細(xì)胞活性的影響。結(jié)果:（1）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第8天即獲得大量BMDC,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),大部分細(xì)胞懸浮離散,可見樹枝狀突起,具有DC的典型形態(tài)學(xué)特征。采用流式細(xì)胞術(shù)對誘導(dǎo)培養(yǎng)第8天DC表面分子情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)CDllc（>90%）,純度滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求,低表達(dá)MHCII、CD... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２：倒置顯微鏡下觀察ＤＣ形態(tài)（４０Ｘ）；?Ａ、Ｂ、Ｃ分別為培養(yǎng)第３、６、８天ＤＣ??３．１．２流ＤＣＣＤｌｌｃ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０

細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)第８天ＤＣ表面⑶１１ｃ表測培養(yǎng)第８天ＤＣ表面ＭＨＣＩＩ、⑶４０、ＣＤ８低表達(dá)ＭＨＣＩＩ及共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８６，態(tài)。???ＣＤ４０??ＨＣＩＩ＊?ＣＤ４０－?ＣＤ４０－＊?ＣＤ８６－１％?６３－４％?３６．６％?５４．２％ｉｆ?＾?ｆ１／?＼Ｊ?＼＾?，Ｌ??．＞??Ｈ??／＇?＇＇＊?ｉ?？＂■［?＇?＇?＇?ｉ＊＂＇ｌ?＇?＇?＇?■?＊?ｉ?■■■■?＇?＇?＇?ＦＩ?１?■?■?■?ｉ?＇?＇０?１０４?１０５?１０６?０?１０４細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)第８天ＤＣ表面分子表

轉(zhuǎn)染４８ｈ后，通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測各組ＤＣ中ＳＯＣＳ３?ｍＲＮＡ水平。各組樣品擴(kuò)增曲??線均能達(dá)到平臺期，表明各個樣品均擴(kuò)增完全，溶解曲線為單峰，表明ＰＣＲ引物具??有良好的特異性，ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果可靠（圖４）。??ｓｉＲＮＡ＃ｌ?Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＤＣ、ｓｉＲＮＡ＃２?Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＤＣ、ｓｉＲＮＡ＃３?Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＤＣ??組ＳＯＣＳ３?ｍＲＭ相對表達(dá)量均明顯低于Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＤＣ組（Ｐ均〈０．０５），提示３條干擾??序列均能有效沉默Ｓ０ＣＳ３基因，干擾效率分別為７３．?７％、８３．?４％、７３．?５％，其中ｓｉＲＮＡ＃２??干擾序列的沉默效率最佳（Ｐ均〈０．０５）；?ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ?ｓｉＲＮＡ?ｔｒｅａｔｅｄ?ＤＣ組與空白??對照組間Ｓ０ＣＳ３?ｍＲＮＡ相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＞０．?０５）。??２４??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞對白念珠菌吞噬、殺傷作用的研究[J]. 王瓊,史冬梅,劉維達(dá).  中國真菌學(xué)雜志. 2016(04)
[2]SOCS3與LIGHT在誘導(dǎo)DC分化成熟中的相互作用[J]. 林蘋,張潔,王琪,陸燕蓉,王修杰,熊竹娟,楊洪亮,任婧婧.  四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2007(04)



本文編號：3298384