本文關鍵詞：抗ICOSL單鏈抗體的人源化改造、表達及其生物學功能鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究旨在通過將抗ICOSL單鏈抗體(anti-ICOSL-scFv)與IgG1 CH3連接,對anti-ICOSL-scFv進行人源化改造,以期獲得對治療器官移植引起的排異反應具有良好抑制作用的融合蛋白。本實驗室之前的研究中,構建了鼠源抗ICOSL單鏈抗體庫,并通過核糖體展示技術從中篩選出抗ICOSL的特異性單鏈抗體(anti-ICOSL-scFv)。但是,由于單鏈抗體缺少了Fc片段,在體內的半衰期短,在血液中很容易被清除。為了彌補這一缺陷,我們將anti-ICOSL-scFv與CH3基因連接,從而對單鏈抗體進行人源化改造。具體結果如下：1 Anti-ICOSL-scFv-CH3基因的克隆首先從人外周血單個核細胞中提取出總RNA；其次運用RT-PCR擴增出IgG1的CH3片段的基因；然后再運用SOE-PCR將CH3基因與anti-ICOSL-scFv的基因連接,獲得重組基因,并通過凝膠電泳和基因測序鑒定重組基因。結果表明：重組的anti-ICOSL-scFv-CH3基因序列與我們預期的一致。2 Anti-ICOSL-svFv-CH3蛋白的表達、純化以及活性檢測將重組基因構建到pET43.1a中,轉入E. coli BL21 (DE3)中進行誘導表達。對經過鑒定的誘導表達正確的抗體用金屬螫合親和層析(Ni-NTA)進行分離純化,得到純度較高的抗體蛋白。并經過間接ELISA和Western blot鑒定其特異性,結果顯示：我們成功構建了anti-ICOSL-scFv-CH3/pET43.1a表達載體,并且重組抗體蛋白與其抗原ICOSL能夠特異性結合。3 Anti-ICOSL-scFv-CH3的生物學功能檢測為了準確地檢測融合蛋白的生物學功能,我們以anti-CD28蛋白和生理鹽水作為陰性對照組,anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白為實驗組,進行小鼠尾部皮膚移植后,分別對不同的組注射抗體蛋白和生理鹽水,并觀察被移植皮膚的愈合情況。實驗結果顯示：相對于anti-CD28蛋白和生理鹽水兩個對照組,注射anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白,對小鼠皮膚移植的抗排異反應的效果比較明顯,移植皮膚的傷口能夠在注射抗體蛋白愈合良好,并逐漸有新鼠毛長出；而兩對照組出現傷口潰爛和結痂等現象。這表明anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白對皮膚移植排異反應具有明顯的抑制作用。Anti-ICOSL-scFv-CH3這一功能蛋白為治療器官移植的排異反應等方面的研究提供了基礎。
【關鍵詞】：ICOSL 單鏈抗體 IgG1 C_H3 人源化改造 器官移植 排異反應
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.4
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一部分 文獻綜述11-34
• 第一章 ICOSL分子的研究進展12-22
• 1.1 ICOSL分子及其受體ICOS分子結構12-14
• 1.2 ICOSL的分布及其表達14
• 1.3 ICOSL的作用機制及生物學功能14-16
• 1.4 ICOSL在相關疾病方面的研究16-18
• 1.4.1 ICOSL與腫瘤16
• 1.4.2 ICOSL與自身免疫性疾病16-17
• 1.4.3 ICOSL與器官移植排異反應17-18
• 參考文獻18-22
• 第二章 單鏈抗體的研究進展22-29
• 2.1 單鏈抗體的結構與構建22-23
• 2.2 單鏈抗體的表達23-24
• 2.3 單鏈抗體的應用24-26
• 2.3.1 單鏈抗體在腫瘤診斷與治療方面的應用24-25
• 2.3.2 單鏈抗體在自身免疫疾病的應用25
• 2.3.3 單鏈抗體在抗器官移植排異反應的應用25-26
• 2.4 單鏈抗體的應用前景與展望26-27
• 參考文獻27-29
• 第三章 抗體人源化研究進展29-34
• 3.1 抗體人源化的策略29-31
• 3.1.1 嵌合型抗體29-30
• 3.1.2 CDR移植抗體30
• 3.1.3 噬菌體抗體庫技術構建的人源化抗體30-31
• 3.2 抗體人源化的應用與前景31-33
• 參考文獻33-34
• 第二部分 實驗研究34-69
• 第四章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3基因的克隆35-48
• 摘要35-36
• Abstract36-37
• 1 材料與方法37-42
• 1.1 主要試劑與材料37-38
• 1.2 實驗方法38-42
• 1.2.1 C_H3基因的克隆38-40
• 1.2.1.1 人外周血單個核細胞(PBMC)的分離38
• 1.2.1.2 PBMC總RNA的提取38
• 1.2.1.3 PBMC的cDNA的合成38-39
• 1.2.1.4 感受態(tài)細胞的制備39
• 1.2.1.5 C_H3基因的擴增以及鑒定39-40
• 1.2.2 Anti-ICOSL-scFv基因片段的擴增40-41
• 1.2.3 Anti-ICOSL-scFv基因片段與C_H3基因的連接41-42
• 2 結果42-45
• 2.1 C_H3基因的克隆42-43
• 2.2 Anti-ICOSL-scFv基因的擴增43-44
• 2.3 Anti-ICOSL-scFv與C_H3基因的連接44-45
• 3 討論45-47
• 參考文獻47-48
• 第五章 Anti-ICOSL-svFv-C_H3蛋白的表達、純化以及活性檢測48-61
• 摘要48-49
• Abstract49-50
• 1 材料與方法50-55
• 1.1 主要試劑與材料50
• 1.2 實驗方法50-55
• 1.2.1 重組表達載體的構建50-52
• 1.2.1.1 質粒的提取50
• 1.2.1.2 酶切反應50-51
• 1.2.1.3 目的片段的磷酸化和載體的去磷酸化51
• 1.2.1.4 目的片段與載體的連接反應51-52
• 1.2.2 重組載體的轉化52
• 1.2.3 菌落PCR鑒定52-53
• 1.2.4 重組anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白誘導表達53
• 1.2.5 重組表達產物的純化53-54
• 1.2.6 免疫印跡(Western blot)分析54
• 1.2.7 ELISA鑒定人源化單鏈抗體的親和力54-55
• 2 結果55-58
• 2.0 重組表達載體的構建55
• 2.1 重組anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白表達與純化55-56
• 2.2 免疫印跡(Western blot)分析56-57
• 2.3 ELISA鑒定人源化單鏈抗體的親和力57-58
• 3 討論58-60
• 參考文獻60-61
• 第六章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3的生物學功能檢測61-69
• 摘要61-62
• Abstract62-63
• 1 材料與方法63-64
• 1.1 主要試劑與材料63
• 1.2 實驗方法63-64
• 1.2.1 實驗分組63
• 1.2.2 供體小鼠皮膚的分離63-64
• 1.2.3 受體小鼠的皮膚移植64
• 2 結果64-65
• 3 討論65-67
• 參考文獻67-69
• 第三部分 全文結論69-71
• 全文結論70-71
• 攻讀碩士學位期間研究成果71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 潘陽;王露楠;;單克隆抗體人源化技術研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2011年13期

  本文關鍵詞：抗ICOSL單鏈抗體的人源化改造、表達及其生物學功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：327871