本文關(guān)鍵詞：抗ICOSL單鏈抗體的人源化改造、表達(dá)及其生物學(xué)功能鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究旨在通過(guò)將抗ICOSL單鏈抗體(anti-ICOSL-scFv)與IgG1 CH3連接,對(duì)anti-ICOSL-scFv進(jìn)行人源化改造,以期獲得對(duì)治療器官移植引起的排異反應(yīng)具有良好抑制作用的融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究中,構(gòu)建了鼠源抗ICOSL單鏈抗體庫(kù),并通過(guò)核糖體展示技術(shù)從中篩選出抗ICOSL的特異性單鏈抗體(anti-ICOSL-scFv)。但是,由于單鏈抗體缺少了Fc片段,在體內(nèi)的半衰期短,在血液中很容易被清除。為了彌補(bǔ)這一缺陷,我們將anti-ICOSL-scFv與CH3基因連接,從而對(duì)單鏈抗體進(jìn)行人源化改造。具體結(jié)果如下：1 Anti-ICOSL-scFv-CH3基因的克隆首先從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取出總RNA；其次運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增出IgG1的CH3片段的基因；然后再運(yùn)用SOE-PCR將CH3基因與anti-ICOSL-scFv的基因連接,獲得重組基因,并通過(guò)凝膠電泳和基因測(cè)序鑒定重組基因。結(jié)果表明：重組的anti-ICOSL-scFv-CH3基因序列與我們預(yù)期的一致。2 Anti-ICOSL-svFv-CH3蛋白的表達(dá)、純化以及活性檢測(cè)將重組基因構(gòu)建到pET43.1a中,轉(zhuǎn)入E. coli BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的誘導(dǎo)表達(dá)正確的抗體用金屬螫合親和層析(Ni-NTA)進(jìn)行分離純化,得到純度較高的抗體蛋白。并經(jīng)過(guò)間接ELISA和Western blot鑒定其特異性,結(jié)果顯示：我們成功構(gòu)建了anti-ICOSL-scFv-CH3/pET43.1a表達(dá)載體,并且重組抗體蛋白與其抗原ICOSL能夠特異性結(jié)合。3 Anti-ICOSL-scFv-CH3的生物學(xué)功能檢測(cè)為了準(zhǔn)確地檢測(cè)融合蛋白的生物學(xué)功能,我們以anti-CD28蛋白和生理鹽水作為陰性對(duì)照組,anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行小鼠尾部皮膚移植后,分別對(duì)不同的組注射抗體蛋白和生理鹽水,并觀察被移植皮膚的愈合情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相對(duì)于anti-CD28蛋白和生理鹽水兩個(gè)對(duì)照組,注射anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白,對(duì)小鼠皮膚移植的抗排異反應(yīng)的效果比較明顯,移植皮膚的傷口能夠在注射抗體蛋白愈合良好,并逐漸有新鼠毛長(zhǎng)出；而兩對(duì)照組出現(xiàn)傷口潰爛和結(jié)痂等現(xiàn)象。這表明anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白對(duì)皮膚移植排異反應(yīng)具有明顯的抑制作用。Anti-ICOSL-scFv-CH3這一功能蛋白為治療器官移植的排異反應(yīng)等方面的研究提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：ICOSL 單鏈抗體 IgG1 C_H3 人源化改造 器官移植 排異反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392.4
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述11-34
• 第一章 ICOSL分子的研究進(jìn)展12-22
• 1.1 ICOSL分子及其受體ICOS分子結(jié)構(gòu)12-14
• 1.2 ICOSL的分布及其表達(dá)14
• 1.3 ICOSL的作用機(jī)制及生物學(xué)功能14-16
• 1.4 ICOSL在相關(guān)疾病方面的研究16-18
• 1.4.1 ICOSL與腫瘤16
• 1.4.2 ICOSL與自身免疫性疾病16-17
• 1.4.3 ICOSL與器官移植排異反應(yīng)17-18
• 參考文獻(xiàn)18-22
• 第二章 單鏈抗體的研究進(jìn)展22-29
• 2.1 單鏈抗體的結(jié)構(gòu)與構(gòu)建22-23
• 2.2 單鏈抗體的表達(dá)23-24
• 2.3 單鏈抗體的應(yīng)用24-26
• 2.3.1 單鏈抗體在腫瘤診斷與治療方面的應(yīng)用24-25
• 2.3.2 單鏈抗體在自身免疫疾病的應(yīng)用25
• 2.3.3 單鏈抗體在抗器官移植排異反應(yīng)的應(yīng)用25-26
• 2.4 單鏈抗體的應(yīng)用前景與展望26-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第三章 抗體人源化研究進(jìn)展29-34
• 3.1 抗體人源化的策略29-31
• 3.1.1 嵌合型抗體29-30
• 3.1.2 CDR移植抗體30
• 3.1.3 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)構(gòu)建的人源化抗體30-31
• 3.2 抗體人源化的應(yīng)用與前景31-33
• 參考文獻(xiàn)33-34
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究34-69
• 第四章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3基因的克隆35-48
• 摘要35-36
• Abstract36-37
• 1 材料與方法37-42
• 1.1 主要試劑與材料37-38
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 1.2.1 C_H3基因的克隆38-40
• 1.2.1.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離38
• 1.2.1.2 PBMC總RNA的提取38
• 1.2.1.3 PBMC的cDNA的合成38-39
• 1.2.1.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備39
• 1.2.1.5 C_H3基因的擴(kuò)增以及鑒定39-40
• 1.2.2 Anti-ICOSL-scFv基因片段的擴(kuò)增40-41
• 1.2.3 Anti-ICOSL-scFv基因片段與C_H3基因的連接41-42
• 2 結(jié)果42-45
• 2.1 C_H3基因的克隆42-43
• 2.2 Anti-ICOSL-scFv基因的擴(kuò)增43-44
• 2.3 Anti-ICOSL-scFv與C_H3基因的連接44-45
• 3 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-48
• 第五章 Anti-ICOSL-svFv-C_H3蛋白的表達(dá)、純化以及活性檢測(cè)48-61
• 摘要48-49
• Abstract49-50
• 1 材料與方法50-55
• 1.1 主要試劑與材料50
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法50-55
• 1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建50-52
• 1.2.1.1 質(zhì)粒的提取50
• 1.2.1.2 酶切反應(yīng)50-51
• 1.2.1.3 目的片段的磷酸化和載體的去磷酸化51
• 1.2.1.4 目的片段與載體的連接反應(yīng)51-52
• 1.2.2 重組載體的轉(zhuǎn)化52
• 1.2.3 菌落PCR鑒定52-53
• 1.2.4 重組anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)53
• 1.2.5 重組表達(dá)產(chǎn)物的純化53-54
• 1.2.6 免疫印跡(Western blot)分析54
• 1.2.7 ELISA鑒定人源化單鏈抗體的親和力54-55
• 2 結(jié)果55-58
• 2.0 重組表達(dá)載體的構(gòu)建55
• 2.1 重組anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白表達(dá)與純化55-56
• 2.2 免疫印跡(Western blot)分析56-57
• 2.3 ELISA鑒定人源化單鏈抗體的親和力57-58
• 3 討論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-61
• 第六章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3的生物學(xué)功能檢測(cè)61-69
• 摘要61-62
• Abstract62-63
• 1 材料與方法63-64
• 1.1 主要試劑與材料63
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法63-64
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組63
• 1.2.2 供體小鼠皮膚的分離63-64
• 1.2.3 受體小鼠的皮膚移植64
• 2 結(jié)果64-65
• 3 討論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 第三部分 全文結(jié)論69-71
• 全文結(jié)論70-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 潘陽(yáng);王露楠;;單克隆抗體人源化技術(shù)研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年13期

  本文關(guān)鍵詞：抗ICOSL單鏈抗體的人源化改造、表達(dá)及其生物學(xué)功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327871