一.研究背景細(xì)胞程序性壞死是一種新近鑒定的細(xì)胞程序性死亡,具有明確的調(diào)控靶點(diǎn)、具體的調(diào)控機(jī)制和確切的生理和病理功能。細(xì)胞程序性壞死是一種可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,只是由于死亡細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞壞死的形態(tài)特征（如細(xì)胞器腫脹和細(xì)胞膜破裂等）,因而被命名為細(xì)胞程序性壞死（programmed cell death,necroptosis）。已有研究表明,死亡配體、化療藥物、病原微生物（細(xì)菌和病毒）入侵等多種因素都能誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死,從而決定了它具有廣泛的生物學(xué)功能,在胚胎發(fā)育,缺血再灌注損傷和炎癥等生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此,鑒定調(diào)控細(xì)胞程序性壞死的新靶點(diǎn)并探討其調(diào)控機(jī)制,可以為細(xì)胞程序性壞死相關(guān)疾病的藥物研發(fā)及臨床治療提供理論指導(dǎo)與參考。FK506結(jié)合蛋白 12（FK506-bindingprotein 12,FKBP12）是一種分子量為12kD的親免素家族蛋白,含有肽基-脯氨酰異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域,可以催化多肽或蛋白質(zhì)脯氨酸殘基中N端肽鍵的順反構(gòu)象變化,改變底物蛋白的活性。同時(shí),FKBP12也可發(fā)揮分子伴侶和接頭蛋白的作用,介導(dǎo)蛋白復(fù)合體的組裝和活化。因此,FKBP12具有多種生物學(xué)功能,... 

【文章來源】：軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：95 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

透射電鏡觀察TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞程序性壞死

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文接下來，我們使用 Annexin V-FITC 和碘化丙錠 （propidium iodide，PI）雙染法（Annexin V-FITC/PI）檢測(cè) TNFα 誘導(dǎo)的 L929 和 HT22 細(xì)胞死亡類型。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示（圖 1.2 A 和 B），TNFα 與 Z-VAD 聯(lián)合處理組 L929 及 HT22細(xì)胞中，大部分都是 Annexin V-FITC 和 PI 雙陽(yáng)性的細(xì)胞（壞死細(xì)胞的特征），而不是 Annexin-V-FITC 單陽(yáng)性（早期凋亡細(xì)胞的特征），表明細(xì)胞發(fā)生的是程序性壞死，而不是凋亡。同時(shí)，我們分別使用 RIPK1，RIPK3 和 MLKL 的抑制劑 Necrostatin-1，GSK’872和 NSA 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn) TNFα 聯(lián)合 Z-VAD 誘導(dǎo)的 L929 和 HT22 細(xì)胞死亡可被這三種抑制劑顯著抑制（圖 1.2 A、B），進(jìn)一步證實(shí)了 TNFα 誘導(dǎo)的 L929 及HT22 細(xì)胞死亡是程序性壞死。因此，我們通過 TEM 超微結(jié)構(gòu)分析、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)及蛋白抑制劑處理實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了在 Z-VAD 存在下，由 TNFα 誘導(dǎo)的 L929 和 HT22 細(xì)胞死亡是程序性壞死，可以作為細(xì)胞模型來鑒定 FKBP12 在細(xì)胞程序性壞死過程中的調(diào)控作用。

L929 細(xì)胞的存活率顯著降低，而 FK506、吡美莫司（pimecrolimus）、雷（rapamycin）、依維莫司（everolimus）、佐他莫司（zotarolimus）和 ridaforol多種 FKBP12 配體都能夠顯著提高 L929 細(xì)胞的存活率，表明 FKBP12 配體制 TNFα 誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死。同時(shí)，我們對(duì) FK506 和 Rapamycin 抑制 TNFα 誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死的結(jié)量化分析。在細(xì)胞程序性壞死過程中，由于細(xì)胞膜的破裂，Annexin V-FIT 都能進(jìn)入細(xì)胞并分別與磷脂酰絲氨酸及 DNA 結(jié)合，形成 Annexin V-FITC 和陽(yáng)性細(xì)胞，因而不存在 Annexin V-FITC 單獨(dú)染色的細(xì)胞，因此，可用 PI 單流式細(xì)胞儀測(cè)定來判斷細(xì)胞的死亡，這一方法在前期發(fā)表的細(xì)胞程序性壞中多有應(yīng)用[65-67]，也是檢測(cè)細(xì)胞程序性壞死的經(jīng)典方法。圖 1.4 的結(jié)果506 和 Rapamycin 都能夠顯著降低 PI 陽(yáng)性 L929 細(xì)胞的比例，表明 FK50pamycin 能夠阻斷 TNFα 誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死，進(jìn)一步驗(yàn)證了 FKBP12 在序性壞死過程中的調(diào)控作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)課題的進(jìn)行提供了重要。

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]腫瘤壞死因子TNFα及冬凌草甲素誘導(dǎo)小鼠成纖維肉瘤L929細(xì)胞死亡的機(jī)制研究[D]. 葉元超.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 2012



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