本文關(guān)鍵詞：角質(zhì)形成細(xì)胞抗原提呈功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)為皮膚表皮的主要組成細(xì)胞,是機(jī)體直接與外界環(huán)境接觸,最先接觸外來抗原的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),KCs不僅形成機(jī)體的物理屏障,同時具有重要的免疫功能。KCs在一些疾病的狀態(tài)下或者直接受到干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子的刺激后,可以表達(dá)抗原提呈相關(guān)分子如主要組織相容性復(fù)合體-II(MHC-II)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)等,同時主要組織相容性復(fù)合體-I(MHC-I)也會較刺激前增高。上述改變使得KCs具備了發(fā)揮抗原提呈功能的先決條件。以往的研究僅僅證明活化后的KCs具備了發(fā)揮抗原提呈的條件,如表達(dá)一些專職抗原提呈細(xì)胞(professional APC)所特有的分子,或者利用動物實(shí)驗(yàn)間接證明了KCs發(fā)揮了抗原提呈的功能,但均未能拿出有說服力的直接證據(jù)。本研究通過利用流式細(xì)胞學(xué)、免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定、Elispot等實(shí)驗(yàn)直接證明了KCs在活化狀態(tài)下可以作為APC發(fā)揮抗原提呈功能。目的:證明KCs在特定條件下可以發(fā)揮抗原提呈功能,鑒定KCs提呈抗原肽的序列及其MHC限制性。方法:1.刺激Ha Ca T細(xì)胞表達(dá)抗原提呈相關(guān)分子:用細(xì)胞因子IFN-γ刺激人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系(Ha Ca T細(xì)胞)致使其活化;2.質(zhì)譜鑒定抗原肽:分別利用MHC-I、MHC-II單克隆抗體對活化后Ha Ca T細(xì)胞胞漿及包膜表面的主要組織相容性復(fù)合體-肽段復(fù)合物(MHC-peptide complex)進(jìn)行免疫共沉淀(Co-IP),用PH3.0的酸液對共沉淀下來的MHC-肽段復(fù)合物進(jìn)行解離,后經(jīng)超濾管離心將兩者分離,通過銀染及蛋白印跡(Western blot)來驗(yàn)證免疫共沉淀的特異性,質(zhì)譜判定MHC上所加載的肽段及其蛋白來源;3.共孵育實(shí)驗(yàn):檢測Ha Ca T細(xì)胞MHC-I和MHC-II每個基因座分型,根據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段結(jié)果預(yù)測目的MHC等位基因;流式細(xì)胞術(shù)分選7例銀屑病病人外周血CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞,將IFN-γ刺激或未刺激Ha Ca T細(xì)胞分別與分選的T細(xì)胞共孵育,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定法(Elispot)觀察T細(xì)胞活化情況;4.MHC限制性驗(yàn)證:測序鑒定上述共孵育實(shí)驗(yàn)陽性患者M(jìn)HC分型,與肽段預(yù)測結(jié)果比對,驗(yàn)證KCs抗原提呈的MHC限制性。結(jié)果:Ha Ca T細(xì)胞受到IFN-γ刺激后膜表面出現(xiàn)MHC-II、ICAM-1的表達(dá),MHC-I表達(dá)較刺激前增高,且隨著IFN-γ刺激濃度及時間的增加,MHC-I、MHC-II的表達(dá)呈劑量和時間依賴性增高。在保證抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)較高及Ha Ca T細(xì)胞狀態(tài)較佳的情況下,選取了IFN-γ最佳刺激濃度及刺激時間(400U/ml,48h)。Co-IP實(shí)驗(yàn)及質(zhì)譜分析結(jié)果顯示:銀染及Western blot證實(shí)MHC抗體可以特異性地沉淀出MHC蛋白。質(zhì)譜成功鑒定出MHC上加載肽段及其蛋白來源,包括來自胞內(nèi)的角蛋白、核糖體蛋白、組蛋白等。無刺激的或IFN-γ刺激的Ha Ca T細(xì)胞分別與7例銀屑病病人的CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn),IFN-γ刺激后的Ha Ca T細(xì)胞可以使1例銀屑病病人的CD4+T細(xì)胞活化,無IFN-γ刺激組的CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞均未活化。結(jié)論:KCs經(jīng)IFN-γ刺激后可以表達(dá)專職APC如樹突狀細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞(MΦ)、B淋巴細(xì)胞(B cells)所特有的MHC-II、ICAM-1等分子,MHC-I表達(dá)也較刺激前明顯增高,說明刺激后的KCs具備了發(fā)揮抗原提呈的條件。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明IFN-γ刺激后,KCs的MHC-I、MHC-II抗原結(jié)合槽中加載了肽段。共孵育實(shí)驗(yàn)說明活化后表達(dá)加載肽段的MHC-II分子的KCs可以活化特異性T細(xì)胞,而未活化的KCs沒有這種功能。
【關(guān)鍵詞】：角質(zhì)形成細(xì)胞 MHC-I MHC-II CD4+T細(xì)胞 CD8+T細(xì)胞 抗原提呈
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R339.11
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 文獻(xiàn)回顧14-24
• 1 材料24-31
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑25-27
• 1.3 主要試劑配方27-31
• 1.4 實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞系31
• 1.5 MHC分型檢測31
• 2 方法31-41
• 2.1 Ha Ca T細(xì)胞表達(dá)抗原提呈相關(guān)分子MHC-I、MHC-II、ICAM-1 的研究.31-34
• 2.2 Ha Ca T細(xì)胞MHC分型檢測34-35
• 2.3 MHC結(jié)合抗原肽的免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)35-39
• 2.4 MHC結(jié)合抗原肽的質(zhì)譜鑒定39
• 2.5 Ha Ca T細(xì)胞活化T細(xì)胞的研究39-41
• 2.6 統(tǒng)計(jì)方法41
• 3 結(jié)果41-49
• 4 討論49-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-64
• 附錄64-65
• 個人簡歷及研究成果65-66
• 致謝66-67

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本文編號：322758