本文關(guān)鍵詞：腸道病毒C組96型（EV-C96）的起源、進(jìn)化及生物學(xué)特征的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：腸道病毒(EV)是小RNA病毒目小RNA病毒科中腸道病毒屬的成員。目前腸道病毒屬共包括了12個(gè)組,即EV-A至EV-J(無(wú)EV-I)和A～C組鼻病毒。EV是最常見(jiàn)的醫(yī)學(xué)病毒之一,但主要以隱性感染居多,很多EV感染人后不出現(xiàn)臨床癥狀或僅有輕微的癥狀,例如非特異性出疹和輕型上呼吸道癥狀。但是,部分人群感染EV后也會(huì)出現(xiàn)各種程度的臨床疾病,如急性馳緩性麻痹(AFP)、急性出血性結(jié)膜炎(AHC)、手足口病(HFMD)、無(wú)菌性腦膜炎、心肌炎及新生兒多器官衰竭等。EV-C包含有我們常見(jiàn)的能引起人類(lèi)疾病的腸道病毒,如引起脊髓灰質(zhì)炎的脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)、引起AHC的柯薩奇病毒A組24型變種(CV-A24v),近年來(lái),一些新型EV-C被發(fā)現(xiàn),并引起了一些疫情的暴發(fā),引起了我們對(duì)除了PV和CV-A24v外的其他EV-C的關(guān)注。EV-C96是一種新型的EV-C,其原型株BAN00-10488株在2000年分離于孟加拉國(guó)一名AFP患者的糞便標(biāo)本,后陸續(xù)在亞歐大陸其他國(guó)家的AFP患者或健康人群或環(huán)境標(biāo)本中有分離到。已有的EV-C96研究結(jié)果顯示其在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)與其它EV-C均有廣泛的重組現(xiàn)象發(fā)生,且不同的EV-C96毒株在細(xì)胞嗜性方面有所不同。由于分離數(shù)量較少,目前尚未對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的進(jìn)化分析,對(duì)其細(xì)胞嗜性特點(diǎn)、致病力等生物學(xué)特征也知之甚少。本研究對(duì)中國(guó)1997～2012年分離的EV-C96進(jìn)行了全基因組測(cè)序,并從分子水平、細(xì)胞水平對(duì)EV-C96進(jìn)行了起源、分子進(jìn)化、生物學(xué)特征的研究。研究目的：通過(guò)對(duì)中國(guó)自1997年起分離的EV-C96的研究,來(lái)揭示EV-C96中國(guó)分離株的基因組特征,系統(tǒng)分析EV-C96的起源、進(jìn)化速度等進(jìn)化參數(shù),闡明我國(guó)EV-C96的地理分布和流行規(guī)律,力求在基因水平上分析其遺傳進(jìn)化趨勢(shì),全面系統(tǒng)地掌握其進(jìn)化和流行情況,并進(jìn)一步探討EV-C96的受體使用情況、溫度敏感性、致病力等生物學(xué)特性及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系。其研究結(jié)果將為我國(guó)新型EV相關(guān)疾病的預(yù)防控制、預(yù)測(cè)預(yù)警提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究方法：通過(guò)RNA提取、引物設(shè)計(jì)、RT-PCR對(duì)中國(guó)分離的EV-C96進(jìn)行全基因組測(cè)序,使用生物信息學(xué)研究方法,如同源性分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)等,分析其基因序列特征和進(jìn)化規(guī)律,采用基于貝葉斯原理的蒙特卡羅-馬爾科夫鏈方法,系統(tǒng)分析EV-C96的起源、進(jìn)化速度等進(jìn)化參數(shù),運(yùn)用血清中和實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞受體阻遏實(shí)驗(yàn)、溫度敏感性實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞與分子生物學(xué)方法研究EV-C96的生物學(xué)特性及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系。研究結(jié)果：1.所有EV-C96中國(guó)分離株在VP1區(qū)核苷酸水平的遺傳距離在0.093～0.226之間,根據(jù)EV的VP1區(qū)核苷酸差異大于15%的基因型劃分標(biāo)準(zhǔn),可將所有中國(guó)EV-C96分離株分成了A～G共7個(gè)基因型。將目前報(bào)道的世界范圍內(nèi)的EV-C96構(gòu)建VP1區(qū)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),所有EV-C96大體可分為三個(gè)簇(cluster),定義為Cluster A、Cluster B1和Cluster B2。 Cluster A與Cluster B1間遺傳距離為0.254～0.305,Cluster A與Cluster B2間遺傳距離為0.235～0.297,Cluster B1與Cluster B2間遺傳距離為0.210-0.265。2.運(yùn)用貝葉斯MCMC方法對(duì)EV-C96核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析,中國(guó)EV-C96株VPl區(qū)核苷酸的平均替換率為6.78×10-3/site/year,最早共同祖先可以追溯到約1972年；世界范圍內(nèi)EV-C96的VP1區(qū)核苷酸的平均替換率為5.31×10-3/site/year,最早共同祖先可追溯到約1930年。對(duì)世界范圍內(nèi)的所有EV-C96的VP1區(qū)全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建分子鐘進(jìn)化樹(shù),所有EV-C96分離株可分為A、B、C、D四個(gè)不同的進(jìn)化分支,所有中國(guó)分離株都位于D分支。3.新疆南疆地區(qū)總體血清EV-C96抗體陽(yáng)性率為65%,陽(yáng)性標(biāo)本抗體幾何平均滴度(GMT)在1：82。其中喀什地區(qū)抗體陽(yáng)性率為70%,GMT在1：82,和田地區(qū)抗體陽(yáng)性率為60%,GMT在1：196�？κ驳貐^(qū)和和田地區(qū)的GMT有較大差異,使用Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)兩地的GMT進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩地區(qū)的GMT存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.001。4.3-193株和GD809株只在RD細(xì)胞上產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),在HEp-2細(xì)胞無(wú)明顯CPE;CHN1045株、CHN1072株、1202F株、882F株、3-156株只在HEp-2細(xì)胞產(chǎn)生CPE,不在RD細(xì)胞產(chǎn)生明顯CPE；2005-T49株、9-13株在RD和HEp-2細(xì)胞均可產(chǎn)生明顯CPE,而2012-94H株在RD和HEp-2細(xì)胞均無(wú)明顯CPE。細(xì)胞受體阻遏實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)HEp-2細(xì)胞被抗ICAM-1抗體阻遏后,882F株不再使HEp-2細(xì)胞產(chǎn)生CPE,說(shuō)明882F株在進(jìn)入HEp-2細(xì)胞并產(chǎn)生CPE,很有可能使用了ICAM-1受體。5.對(duì)中國(guó)EV-C96分離株進(jìn)行了溫度敏感性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其中一株新疆分離株(3-193株)為溫度敏感株,其它毒株均為溫度不敏感株,將敏感株和非敏感株進(jìn)行氨基酸和核苷酸水平比較,在3-193株的開(kāi)放讀碼框架(ORF)中找到13個(gè)特異的氨基酸及核苷酸變異位點(diǎn),5’-UTR找到3個(gè)特殊的核苷酸變異位點(diǎn)。研究結(jié)論：1.中國(guó)分離的EV-C96的VPl區(qū)核苷酸進(jìn)化速率較快,變異大,在中國(guó)地區(qū)存在多個(gè)基因型,但都有著共同的起源。在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)存在多重重組,且均在2B區(qū)、2C區(qū)的5’端、3A區(qū)最有可能與CV-A24v重組。2.EV-C96各分離株之間存在不同的細(xì)胞嗜性,其中在HEp-2細(xì)胞生長(zhǎng)并產(chǎn)生CPE的毒株很有可能使用了ICAM-1受體。3.血清中和試驗(yàn)顯示EV-C96在新疆喀什地區(qū)和和田地區(qū)血清中EV-C96抗體總體陽(yáng)性率較高,存在較為廣泛的流行,說(shuō)明EV-C96隱性感染居多,且可能存在近期感染,應(yīng)加強(qiáng)新疆地區(qū)腸道病毒監(jiān)測(cè)。4.一株新疆EV-C96分離株(3-193株)為溫度敏感株。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒96型 進(jìn)化 重組 細(xì)胞受體
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 一、引言13-21
• 1.1 腸道病毒概述13-14
• 1.2 腸道病毒基因組與結(jié)構(gòu)14-15
• 1.3 腸道病毒的生活周期15-16
• 1.4 腸道病毒的進(jìn)化16-17
• 1.5 腸道病毒分類(lèi)以及分型方法17-18
• 1.6 腸道病毒C組96型(EV-C96)的背景和研究現(xiàn)狀18-21
• 二、材料與方法21-39
• 2.1 材料21-24
• 2.2 方法24-39
• 2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇24-25
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.2.3 細(xì)胞凍存26
• 2.2.4 噬斑純化EV-C9626-29
• 2.2.5 EV-C96細(xì)胞嗜性研究29
• 2.2.6 EV-C96全基因組序列測(cè)定29-33
• 2.2.7 基因組序列特征及進(jìn)化關(guān)系分析33-34
• 2.2.8 EV-C96全基因組重組分析34
• 2.2.9 BEAST軟件進(jìn)行EV-C96分子進(jìn)化起源分析34-35
• 2.2.10 病毒滴度(CCID_(50))測(cè)定35
• 2.2.11 血清EV-C96中和抗體測(cè)定35-38
• 2.2.12 9株EV-C96分離株的溫度敏感實(shí)驗(yàn)38
• 2.2.13 抗病毒受體抗體的阻遏實(shí)驗(yàn)38-39
• 三、結(jié)果39-73
• 3.1 EV-C96各毒株間細(xì)胞嗜性各不相同39-42
• 3.2 9株EV-C96全基因組特征分析42-47
• 3.3 EV-C96的VP1區(qū)基因特征分析47-50
• 3.4 中國(guó)分離EV-C96均在5’-UTR區(qū)和非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)發(fā)生重組50-63
• 3.5 EV-C96的起源進(jìn)化分析63-67
• 3.6 新疆南疆地區(qū)EV-C96血清流行病學(xué)67-68
• 3.7 9株EV-C96中國(guó)分離株的溫度敏感性不同68-71
• 3.8 EV-C96在RD細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞上使用受體類(lèi)型的初步研究71-73
• 四、討論73-76
• 五、結(jié)論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-83
• 綜述83-91
• 參考文獻(xiàn)88-91
• 致謝91-93
• 研究生期間發(fā)表和待發(fā)表的論文93

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：320128