目的制備新布尼亞病毒（severe fever thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs）多克隆抗體,進一步發(fā)現(xiàn)NSs基因的結(jié)構(gòu)和功能,為深入探究SFTSV的致病機理奠定基礎(chǔ)。方法1.PGEX-6P-SFTSV NSs重組蛋白的表達與純化:以提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,擴增SFTSV-NSs片段,分別連接到PGEX-6P-1載體和PFLAG-CMV-3載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PGEX-6P-SFTSV NSs轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進行克隆,將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21中,表達重組蛋白。經(jīng)過誘導(dǎo)條件優(yōu)化,選擇最適條件,大量誘導(dǎo)重組蛋白,經(jīng)GST親和柱層析過濾以獲得高純度的PGEX-6P-SFTSV NSs重組蛋白。2.PGEX-6P-SFTSV NSs多克隆抗體的制備:將純化后的PGEX-6P-SFTSV NSs重組蛋白與完全佐劑混合,制備抗原,免疫新西蘭大白兔,改用不完全佐劑后再免疫四次,得到的抗體經(jīng)Western Blotting及ELISA檢測抗體的特異性及效價。3.多克隆抗體的應(yīng)用:對感... 

【文章來源】：錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

SFTSVNSs原核表達PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

1 SFTSV NSs 原核表達 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)注： 1 和 2 均為 SFTSV NSs 目的片段SV NSs 真核表達基因的擴增結(jié)果A 為模板，使用特異性引物 SFTSV-NamHI）進行 PCR 擴增， 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖可見，在 877bp 左右有一條亮帶，與預(yù)期 SSV NSs 原核表達基因擴增成功，且條帶單

粒構(gòu)建及測序鑒定XhoI 雙酶切原核 PCR 純化產(chǎn)物和空載體 PGEX-6，用 EcoRI/XhoI 雙酶切鑒定。用 EcoRI/BamHI 雙體 PFLAG-CMV-3 質(zhì)粒，回收目的片段并連接，泳顯示有和預(yù)期大小一致的酶切片段，證明質(zhì)粒6P- SFTSV NSs 和 SFTSV NSs-Flag。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3131836