本文關(guān)鍵詞：牛布魯氏菌抗原蛋白的克隆表達(dá)及其刺激能力的評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患傳染病。感染布病之后會(huì)累及多個(gè)器官的功能衰退,表現(xiàn)為流產(chǎn)和不孕不育等癥狀,且病程較長,難以治愈,嚴(yán)重者喪失勞動(dòng)和生活能力。布病在世界各地的廣泛流行,在給社會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也嚴(yán)重威脅著社會(huì)的健康安全,及時(shí)準(zhǔn)確地診斷布病是防控布病的關(guān)鍵因素之一。常規(guī)的布病診斷方法利用LPS作為檢測(cè)抗原,但由于布病疫苗的使用以及LPS與耶爾森菌等之間存在抗原結(jié)構(gòu)相似性,布病的診斷容易出現(xiàn)假陽性和交叉反應(yīng),所以只有先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法才能準(zhǔn)確診斷布病。本研究通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了rHis-L7/L12(基因名rplL)、rHis-Bp26、 rHis-GroEL、rHis-CuZn-SOD(基因名S、odl)、rHis-P39和rHis-Omp25等6種布魯氏菌抗原蛋白,并使用其中的5種以可溶形式表達(dá)的重組蛋白及布魯氏菌素(Br-PPD)進(jìn)行牛布病外周血IFN-γ體外釋放試驗(yàn),以期望篩選出具有良好刺激效果的特異性IFN-γ刺激原,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。1、布魯氏菌6種抗原蛋白的重組表達(dá)、純化和鑒定根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR擴(kuò)增的方法獲得rplL、groEL、bp26、omp25、p39和sod1目的片段,大小分別為375 bp、1641 bp、753 bp、642 bp、1206 bp和522 bp,將目的片段連接到載體并進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。將測(cè)序正確的目的片段轉(zhuǎn)入表達(dá)載體,最終構(gòu)建了pET-28a(+)-rplL、pCold Ⅰ-groEL、pCold Ⅰ-bp26、pCold Ⅰ-omp25、pCold Ⅰ-p39(?)pCold Ⅰ-sod1原核表達(dá)質(zhì)粒,分別將6種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)以及SDS-PAGE結(jié)果分析,分別出現(xiàn)預(yù)期的目的條帶,大小分別為20 kDa、65 kDa、33 kDa、28 kDa、47 kDa和24 kDa,說明重組蛋白獲得表達(dá),其中rHis-L7/L12、rHis-GroEL rHis-Bp26、rHis-P39 和 rHis-CuZn-SOD以胞內(nèi)可溶形式表達(dá),rHis-Omp25為包涵體形式表達(dá)。通過His免疫親和層析法進(jìn)行蛋白的純化,Western blot結(jié)果顯示6種重組蛋白均能與His單抗發(fā)生特異性反應(yīng),表明6種重組蛋白獲得成功表達(dá)。2、牛布魯氏菌抗原蛋白的刺激能力評(píng)價(jià)使用本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化的5種重組蛋白以及Br-PPD進(jìn)行牛布病外周血IFN-y體外釋放試驗(yàn)的檢測(cè)。在臨床樣品的刺激實(shí)驗(yàn)中,以L7/L12為刺激原的IFN-γ釋放試驗(yàn)與ELISA檢測(cè)結(jié)果之間表現(xiàn)出最高的正相關(guān)性(Pearson's r0.6), 其次為Br-PPD(Pearson's r0.2)具有一定相關(guān)性,也表現(xiàn)出一定的刺激潛力；在5種重組蛋白以及Br-PPD進(jìn)行的樣品檢測(cè)中,以L7/L12和Br-PPD為刺激原的IFN-γ體外釋放試驗(yàn)與ELISA檢測(cè)結(jié)果之間具有較高的符合率(總符合率均為89.0%),L7/L12的敏感性、特異性、陽性符合率和陰性符合率分別為50.0%,96.7%,75.0%和90.7%,表現(xiàn)出作為刺激原的潛能。Br-PPD的敏感性、特異性、陽性符合率和陰性符合率分別54.8%,94.1%,70.8%和88.9%,顯示出良好的刺激能力。而其他4種重組蛋白則沒有顯示出較好的符合率。綜上所述,在5種候選抗原和Br-PPD中,Br-PPD和L7/L12作為牛布病外周血IFN-y體外釋放試驗(yàn)的刺激原具有明顯優(yōu)勢(shì),而Bp26、GroEL、P39和CuZn-SOD不具有作為刺激原的潛力。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌病 原核表達(dá) 重組蛋白 IFN-γ 刺激原
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61;R378.5
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-7
• 符號(hào)說明7-9
• 綜述9-22
• 1 布魯氏菌病概述9
• 1.1 布魯氏菌病病原及特征9
• 1.2 流行病學(xué)9
• 1.3 布魯氏菌病疫情及危害9
• 2 牛布魯氏菌病診斷的研究進(jìn)展9-12
• 2.1 細(xì)菌學(xué)檢查10
• 2.2 分子生物學(xué)診斷10-11
• 2.3 血清學(xué)方法11
• 2.4 布魯氏菌素皮試試驗(yàn)11
• 2.5 抗原特異性的IFN-γ診斷方法11-12
• 3 診斷抗原研究進(jìn)展12-16
• 3.1 外膜蛋白12-14
• 3.2 菌體蛋白14-15
• 3.3 其他蛋白15-16
• 4 總結(jié)16
• 參考文獻(xiàn)16-22
• 第一章 布魯氏菌6種抗原蛋白的重組表達(dá)、純化和鑒定22-40
• 1 材料與方法22-29
• 1.1 材料22-23
• 1.2 方法23-29
• 2 結(jié)果29-37
• 2.1 目的基因擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的鑒定29-32
• 2.2 重組蛋白的SDS-PAGE分析32-36
• 2.3 重組蛋白的Western blot分析36-37
• 3 討論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 第二章 牛布魯氏菌抗原蛋白刺激能力的評(píng)價(jià)40-52
• 1 材料與方法40-42
• 1.1 材料40-41
• 1.2 方法41-42
• 2 結(jié)果42-47
• 3 討論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 致謝52-53
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李玉蘭,陳洪科,侯安祖,魏永順;河南省1990～1996年布魯氏菌病全國監(jiān)測(cè)點(diǎn)監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)[J];中國畜禽傳染病;1998年04期

2 孫天志 ,崔玉蘭;用E玫瑰花環(huán)激活試驗(yàn)研究豚鼠實(shí)驗(yàn)性布病的疾病狀態(tài)和康復(fù)趨勢(shì)[J];中國地方病學(xué)雜志;1983年03期

3 ;[J];;年期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Q，

本文編號(hào)：310577