目的制備兔抗人MiR-338分子多克隆抗體。方法 PCR法擴增出MiR-338基因,將其克隆入原核表達載體pET28中,轉化大腸桿菌BL21（DE3）、IPTG誘導重組蛋白的表達, Ni²⁺-NTA Agarose親和層析法純化重組蛋白,以之為免疫原免疫家兔,制備多克隆抗體,并用ELISA、Western blot和免疫組織化學法檢測抗體。結果成功構建了MiR-338原核表達載體pET28/MiR-338,高效表達并純化MiR-338蛋白,間接ELISA檢測所制備抗體的效價為1:6400,Western blot顯示該抗體能與MiR-338特異結合,免疫組織化學法檢測結果表明該抗體識別人卵巢癌組織中的天然的MiR-338。結論成功地制備了效價高、特異性較強兔抗人MiR-338抗體,為進一步建立MiR-338的ELISA檢測方法和探討MiR-338在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中所起的重要作用奠定了良好的基礎。 

【文章來源】：九江學院學報(自然科學版). 2020,35(02)

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【部分圖文】：

瓊脂糖凝膠電泳分析KiSS- 1 RT-PCR 擴增產物

最佳誘導條件確定為在28℃條件加入的IPTG終濃度應為0.5mmol/L,最佳誘導時間為5h。誘導表達的MiR-338融合蛋白SDS-PAGE和westernblot鑒定結果,見圖2。在Mr約52KD處有一條高表達的外源蛋白條帶,與預測的目的蛋白的Mr相吻合,從500mL細菌培養(yǎng)液中純化得到約3mg蛋白,經(jīng)凝膠掃描分析顯示,所得的蛋白純度為93%,純度較高。2.4抗血清的效價及特異性的鑒定

利用純化的重組MiR-338為抗原,通過常規(guī)免疫家兔,獲得兔抗人MiR-338抗體,ELISA檢測效價其為1:6400,可用于對抗原進行檢測。以制備的兔抗人MiR-338血清作一抗,進行Western blot檢測,結果顯示,誘導表達菌蛋白及純化蛋白出現(xiàn)了特異反應條帶,而在未加誘導劑的菌體蛋白中未見有反應條帶,表明所制備的抗體與人MiR-338特異結合。應用所制備的抗體檢測人卵巢癌組織石蠟切片,免疫組織化學染色結果顯示,制備的抗體作為一抗有明顯的陽性著色,每批染色均用已知陽性切片做陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照,以細胞質和/ 或細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆料為陽性細胞。而應用正常家兔血清為一抗則無陽性著色(圖3),說明所制備的兔抗人MiR-338抗體可特異識別天然狀態(tài)下的MiR-338分子,抗體具有良好的活性和高特異性。3 討論


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