發(fā)布時(shí)間：2021-02-28 10:28

　　H7N9流感病毒是2013年新出現(xiàn)在人群中的禽流感病毒,其也是繼1997年人感染H5N1禽流感病毒后又一個(gè)先在人群中鑒定發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒。這種新出現(xiàn)的病毒由野鳥(niǎo)的H7亞型和N9亞型流感病毒表面基因以及家禽的H9N2流感病毒內(nèi)部基因重組而來(lái)。H7N9流感病毒已經(jīng)存在于中國(guó)家禽群體中,而且表現(xiàn)出向人或其他哺乳動(dòng)物模型傳播的能力比H5Nx病毒更強(qiáng)。研究表明,在細(xì)菌及其他病毒感染過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)元素鐵發(fā)揮了一定作用,而在H7N9流感病毒感染過(guò)程中鐵是否發(fā)揮作用以及鐵代謝基因HFE作為類MHC I分子的免疫功能尚未見(jiàn)報(bào)道,因此本研究對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素鐵及其代謝基因hfe對(duì)H7N9流感病毒感染的影響及其機(jī)理進(jìn)行了探討。對(duì)H7N9流感病毒感染患者和H7N9流感病毒流行期間無(wú)癥狀人群血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn),H7血凝抗體陽(yáng)性者均表現(xiàn)血清ferritin含量升高,血清鐵含量降低,表明鐵在H7N9流感病毒感染過(guò)程中的重要性。H7N9流感病毒感染小鼠富鐵、缺鐵模型試驗(yàn)結(jié)果顯示,富鐵組體重與正常鐵組體重相比偏低,且下降迅速回升緩慢;而缺鐵組與正常組相比同期體重較高;感染后富鐵組小鼠死亡出現(xiàn)最早（第4天）,14天內(nèi)死亡率達(dá)到41.1%,... 

【文章來(lái)源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：156 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
Abstract
研究意義
技術(shù)路線
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 我國(guó)H7N9流感病毒的概況
        1.1 人感染H7N9流感病毒的出現(xiàn)和流行
        1.2 H7N9流感病毒的溯源
        1.3 H7N9流感病毒的進(jìn)化、傳播和發(fā)展
    第二章 流感病毒感染的先天免疫應(yīng)答
        2.1 先天免疫對(duì)流感病毒感染的識(shí)別
            2.1.1 TLR介導(dǎo)的流感病毒感染的識(shí)別
            2.1.2 RIG-I監(jiān)視感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的病毒RNA
            2.1.3 NLRP3炎性體感知細(xì)胞的損傷
        2.2 抗流感病毒的ISGs
        2.3 疾病耐受性抗感染的機(jī)理
        2.4 誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的先天信號(hào)途徑
    第三章 鐵代謝及其對(duì)病原感染時(shí)先天免疫應(yīng)答的影響
        3.1 全身鐵代謝
        3.2 鐵蛋白對(duì)疾病的影響
            3.2.1 鐵調(diào)素
            3.2.2 乳鐵蛋白
            3.2.3 噬鐵蛋白
            3.2.4 亞鐵血紅素鐵因子
            3.2.5 非亞鐵血紅素鐵因子
        3.3 鐵代謝對(duì)病毒感染的影響
            3.3.1 病毒靶定鐵代謝中的蛋白
            3.3.2 鐵螯合劑的抗病毒作用
    第四章 血色沉著病相關(guān)基因HFE的研究進(jìn)展
        4.1 Hfe基因的定位與克隆
        4.2 Hfe基因結(jié)構(gòu)
        4.3 HFE蛋白結(jié)構(gòu),細(xì)胞和組織分布
            4.3.1 HFE蛋白結(jié)構(gòu)
            4.3.2 HFE在細(xì)胞和組織中的分布
        4.4 HFE功能
            4.4.1 Hfe敲除
            4.4.2 Hfe敲入
            4.4.3 鐵吸收
第二部分 研究?jī)?nèi)容
    第一章 H7N9流感病毒感染與體內(nèi)鐵水平的關(guān)系
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2 試驗(yàn)方法
            1.2.1 血清鐵和血清Ferritin檢測(cè)
                1.2.1.1 血清的獲取
                1.2.1.2 雞胚擴(kuò)繁A型流感病毒PR8、H7N9毒株
                1.2.1.3 血凝實(shí)驗(yàn)
                1.2.1.4 血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)
                1.2.1.5 血清鐵、ferritin檢測(cè)
            1.2.2 不同鐵水平小鼠的H7N9流感病毒感染
                1.2.2.1 Bal B/C小鼠預(yù)處理
                1.2.2.2 小鼠處理后的鐵含量測(cè)定
                1.2.2.3 不同鐵水平小鼠感染H7N9流感病毒體重變化及死亡率檢測(cè)
                1.2.2.4 肺臟中病毒載量的測(cè)定
                1.2.2.5 膳食鐵處理小鼠感染H7N9流感病毒后免疫水平檢測(cè)
            1.2.3 右旋糖酐鐵及地拉羅司在小鼠感染后的治療效果
            1.2.4 感染發(fā)生后鐵代謝基因的變化
                1.2.4.1 Bal B/C小鼠感染后肝、脾、肺中鐵代謝基因的變化
                1.2.4.2 A549細(xì)胞感染H7N9流感病毒后鐵代謝基因的變化
        1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            1.3.1 臨床血清學(xué)檢測(cè)
                1.3.1.1 雞胚擴(kuò)增流感病毒紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定
                1.3.1.2 臨床血清血凝抑制試驗(yàn)
                1.3.1.3 各亞型抗體陽(yáng)性與血清鐵和ferritin關(guān)系
            1.3.2 不同鐵含量鼠糧對(duì)Bal B/C小鼠感染H7N9流感病毒的影響
                1.3.2.1 飼喂處理后肝和血清鐵含量
                1.3.2.2 富鐵、缺鐵模型小鼠感染H7N9流感病毒體重變化和存活率
                1.3.2.3 富鐵、缺鐵模型小鼠感染H7N9流感病毒肺臟病理變化
                1.3.2.4 富鐵、缺鐵模型小鼠感染H7N9流感病毒肺臟免疫應(yīng)答分析
                1.3.2.5 脾臟、肺臟以及肺泡灌洗液全血中T細(xì)胞亞群
            1.3.3 右旋糖酐鐵及地拉羅司在小鼠感染后的治療效果
                1.3.3.1 小鼠體重變化及死亡率
                1.3.3.2 給藥后第7天與給藥后第12天肝鐵的含量
                1.3.3.3 給藥后第7天各組肺臟病理變化
                1.3.3.4 給藥后第7天各組肺臟組織中病毒蛋白NP轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
            1.3.4 感染發(fā)生后鐵代謝基因的變化
                1.3.4.1 Bal B/C小鼠感染后各臟器中鐵代謝基因變化
                1.3.4.2 A549細(xì)胞感染H7N9流感病毒后鐵代謝基因變化
        1.4 討論
    第二章 Hfe敲除小鼠感染H7N9流感病毒
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2 試驗(yàn)方法
+/+,hfe^-/-死亡率及體重變化">            2.2.1 Hfe^+/+,hfe^-/-死亡率及體重變化
            2.2.2 感染后小鼠臟器的采集
            2.2.3 感染后WT,KO小鼠免疫細(xì)胞水平檢測(cè)
            2.2.4 感染后小鼠臟器中細(xì)胞因子mRNA水平檢測(cè)
            2.2.5 感染后小鼠肺臟病理觀察
            2.2.6 不同鐵含量飼料飼喂對(duì)KO小鼠感染H7N9流感病毒的影響
        2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.3.1 WT,KO小鼠的體重變化及死亡率
            2.3.2 WT,KO小鼠感染后肺臟病毒蛋白基因以及細(xì)胞因子水平
                2.3.2.1 肺臟中病毒蛋白、細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平
                2.3.2.2 血清及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子水平
            2.3.3 WT,KO小鼠感染后肺臟病理變化
            2.3.4 脾臟、肺泡灌洗液（BALF）中免疫細(xì)胞水平
            2.3.5 KO小鼠膳食鐵處理感染H7N9流感病毒
        2.4 討論
    第三章 HFE影響H7N9流感病毒感染機(jī)制研究
        3.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1 生物材料及試劑
            3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2 試驗(yàn)方法
            3.2.1 HFE和MAVS載體構(gòu)建
                3.2.1.1 根據(jù)載體序列和HFE、MAVS序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)
                3.2.1.2 擴(kuò)增HFE,MAVS片段
                3.2.1.3 HFE與MAVS載體的構(gòu)建
                3.2.1.4 HFE與MAVS原核蛋白的表達(dá)及純化
            3.2.2 Western Blot分析HFE降解MAVS
                3.2.2.1 293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)3×Flag-MAVS與Myc-HFE
                3.2.2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞樣品收集
                3.2.2.3 SDS電泳樣品制備并進(jìn)行SDS電泳
                3.2.2.4 蛋白轉(zhuǎn)印
                3.2.2.5 抗體孵育顯色
            3.2.3 免疫熒光檢測(cè)MAVS與HFE定位關(guān)系
            3.2.4 HFE與MAVS的相互作用
                3.2.4.1 共轉(zhuǎn)染HFE和MAVS的免疫共沉淀
+/+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀">                3.2.4.2 Hfe^+/+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀
                3.2.4.3 HFE和MAVS的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
            3.2.5 腹腔巨噬細(xì)胞中HFE介導(dǎo)MAVS的降解
            3.2.6 HFE介導(dǎo)MAVS降解機(jī)制探討
+/+與hfe^-/-BMDM細(xì)胞中MAVS的mRNA水平檢測(cè)">                3.2.6.1 Hfe^+/+與hfe^-/-BMDM細(xì)胞中MAVS的mRNA水平檢測(cè)
                3.2.6.2 HFE對(duì)MAVS的蛋白酶活性分析
                3.2.6.3 HFE介導(dǎo)MAVS降解的通路探討
        3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.3.1 HFE與MAVS載體構(gòu)建及原核表達(dá)
                3.3.1.1 PCR擴(kuò)增MAVS及HFE基因片段
                3.3.1.2 MAVS及HFE的原核表達(dá)與純化
            3.3.2 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染3×Flag-MAVS與Myc-HFE
            3.3.3 免疫熒光檢測(cè)MAVS與HFE的定位
                3.3.3.1 共聚焦顯微觀察MAVS與HFE及其突變體共定位情況
                3.3.3.2 共聚焦顯微觀察MAVS及其突變體與HFE共定位情況
            3.3.4 HFE與MAVS相互作用探討
                3.3.4.1 過(guò)表達(dá)的HFE與MAVS免疫共沉淀
                3.3.4.2 腹腔巨噬細(xì)胞中HFE與MAVS的免疫共沉淀
                3.3.4.3 HFE與MAVS的蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
+/+和hfe^-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)MAVS的變化">            3.3.5 Hfe^+/+和hfe^-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)MAVS的變化
            3.3.6 HFE介導(dǎo)MAVS蛋白下調(diào)表達(dá)
                3.3.6.1 WT和KO BMDM細(xì)胞中MAVS mRNA水平檢測(cè)
                3.3.6.2 HFE對(duì)MAVS的蛋白酶活性試驗(yàn)
                3.3.6.3 化學(xué)小分子藥物處理對(duì)HFE介導(dǎo)MAVS降解的影響
        3.4 討論
全文總結(jié)
展望
References
第三部分 附錄
致謝



本文編號(hào)：3055717