目的觀察寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys后引起炎癥因子的變化,以及誘導細胞死亡的方式。方法用寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys,在不同時間點收集細胞培養(yǎng)上清并提取細胞總RNA和細胞總蛋白。采用Luminex xMAP技術(shù)檢測上清中GM-CSF、IL-6、IL-8、TNFα、CCL-2、MDC、CCL-5、INFα、MDC、IL-12p70細胞因子含量;采用熒光定量PCR檢測目的基因在mRNA水平的相對表達量;采用Western blot檢測目的基因在蛋白水平的相對表達量;采用CCK-8檢測細胞活力;采用LDH釋放試驗檢測細胞膜損傷程度;采用流式細胞術(shù)檢測細胞Annexin V-FITC/PI雙標染色細胞分群。結(jié)果寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys后引起GM-CSF、IL-6、IL-8、TNFα、CCL-2、CCL-5分泌增加,熒光定量PCR結(jié)果與Luminex xMAP檢測結(jié)果一致;寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys 72h后焦亡相關(guān)基因在mRNA水平表達增加,焦亡相關(guān)蛋白被激活,細胞活力下降50%,細胞膜完整性喪失,轉(zhuǎn)染siRNA-NLRP3或加入N... 

【文章來源】：中國病原生物學雜志. 2020,15(07)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

寨卡病毒感染SH-SY5Ys引起的細胞焦亡

將HUVECs接種于96板中,用不同MOI的寨卡病毒感染細胞,分別在感染后12、24、48、72 h用CCK-8檢測細胞活力,用LDH釋放檢測試劑盒檢測各組LDH釋放程度,評估細胞膜完整性。結(jié)果顯示,在病毒感染72 h,MOI分別為1和10時細胞活力下降至56%、51%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2A)。病毒感染48～72 h,MOI為1和10實驗組的LDH釋放量相對于對照組增加10%～13%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2B),說明寨卡病毒感染HUVECs后細胞膜完整性喪失。因此將寨卡病毒感染后48 h和72 h作為凋亡和焦亡研究的時間點。將HUVECs接種于6孔板中,處理方法同前,用熒光定量PCR檢測寨細胞內(nèi)焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達情況。結(jié)果顯示,寨卡病毒感染72 h后,當MOI分別是0.1、1、10時,NLRP3相對表達量依次為對照組的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相對表達量依次為對照組的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相對表達量依次為對照組的4.5、5.58、3.67倍,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持續(xù)復(fù)制,隨著時間的增加,MOI越大,病毒的相對表達量越高(圖2C)。用Western blot檢測焦亡相關(guān)基因在蛋白水平的表達情況,結(jié)果顯示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的條帶明顯加深(圖2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步說明寨卡病毒感染HUVECs后發(fā)生了焦亡。

將HUVECs接種于6孔板中,處理方法同前,用熒光定量PCR檢測寨細胞內(nèi)焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達情況。結(jié)果顯示,寨卡病毒感染72 h后,當MOI分別是0.1、1、10時,NLRP3相對表達量依次為對照組的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相對表達量依次為對照組的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相對表達量依次為對照組的4.5、5.58、3.67倍,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持續(xù)復(fù)制,隨著時間的增加,MOI越大,病毒的相對表達量越高(圖2C)。用Western blot檢測焦亡相關(guān)基因在蛋白水平的表達情況,結(jié)果顯示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的條帶明顯加深(圖2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步說明寨卡病毒感染HUVECs后發(fā)生了焦亡。將HUVECs接種于6孔板中,處理方法同前,用凋亡檢測試劑盒檢測不同時間點、不同MOI凋亡細胞群的分布情況。結(jié)果顯示,處于Q2即PI陰性而Annexin-V FITC陽性的早期凋亡細胞群和處于Q3即PI和Annexin-V FITC雙陽性的晚期凋亡細胞群著時間的延長,MOI越大,這兩部分細胞越多。感染72 h后,MOI為10的Q2+Q3細胞比例達18%,是對照組的4倍,初步判斷寨卡病毒感染HUVECs后發(fā)生了凋亡(圖2F)。同時,提取細胞內(nèi)總蛋白,檢測凋亡相關(guān)基因蛋白含量的變化,結(jié)果顯示寨卡病毒感染72 h后,細胞內(nèi)Caspase-3的活性片段和BAX的蛋白表達水平與對照組相比明顯增加,說明寨卡病毒感染HUVECs后發(fā)生了依賴于Caspase-3激活的細胞凋亡,與流式結(jié)果相互印證(圖2E)。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Identification of various cell culture models for the study of Zika virus[J]. Kiyoshi Himmelsbach,Eberhard Hildt.  World Journal of Virology. 2018(01)



本文編號：3054106