目的 :構(gòu)建大鼠IL-6基因啟動子（全長和截短）熒光素酶報告質(zhì)粒并予鑒定,觀察人胚腎細(xì)胞（HEK293）中過表達(dá)CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β（CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ）對該質(zhì)�；騿幼踊钚缘挠绊�。同時,篩選C/EBPβ與IL-6基因啟動子區(qū)的結(jié)合位點。方法:采用PCR技術(shù),擴增出大鼠IL-6基因啟動子全長序列（-1 791～+30 nt）,將IL-6基因啟動子插入熒光素酶報告基因載體pGL3-basic中。將IL-6基因啟動子全長熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3-IL-6-1）和大鼠野生型C/EBPβ表達(dá)質(zhì)粒（pIRES2-EGFP-C/EBPβ）共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,檢測其熒光素酶活性,確定C/EBPβ對IL-6基因的啟動作用。另用生物信息學(xué)軟件預(yù)測IL-6基因啟動子上C/EBPβ潛在的結(jié)合位點,并構(gòu)建IL-6基因啟動子截短的熒光素酶報告質(zhì)粒（即pGL3-IL-6-2～5）。將上述IL-6基因啟動子全長和各截短的熒光素酶報告質(zhì)粒和C/EBPβ過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,再行熒光素酶活性測定,篩選出C/EBPβ的結(jié)合位點。結(jié)果:菌... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2013,33(06)北大核心

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／EBPβ過表達(dá)對大鼠IL-6蛋白表達(dá)的影響

rluciferaseactivity（fold）86420*1：pGL3-IL-6-1＋pIRES2；2：pGL3-IL-6-1＋pIRES2-EGFP-C／EBPβ；3：pIRES2；4：pGL3-basic。與1、3、4組比較，*P＜0．001（n＝3）圖3C／EBPβ對于大鼠IL-6基因啟動子全長活性的影響Figure3TheeffectofC／EBPβontheluciferaseactivityofratIL-6genepromoter（full-length）A：PCR擴增結(jié)果，M：DNAMarker；1～3：3個克隆的pGL3-IL-6-1質(zhì)粒菌液PCR擴增產(chǎn)物；B：重組IL-6啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒的測序圖譜（部分）。圖1重組IL-6基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒的鑒定Figure1IdentificationofluciferasereporterplasmidforIL-6genepromoter200010007502501005001821bpbpM123ApGL3-basic／IL-6-1B1234龐蓉蓉等：大鼠IL-6基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與C／EBPβ結(jié)合位點的鑒定第33卷第6期2013年6月·725·

-6-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將pGL3-IL-6-1與pIRES2-EGFP-C／EBPβ共轉(zhuǎn)染后，其熒光素酶活性明顯強于pGL-3-basic對照組。提示C／EBPβ作為轉(zhuǎn)錄因子能夠啟動IL-6基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究發(fā)現(xiàn)，C／EBPβ可以促進(jìn)人IL-6基因的表達(dá)［11］。另有實驗證實，C／EBPβ作為一種轉(zhuǎn)錄因子能與小鼠IL-6基因啟動子上的效應(yīng)元件相結(jié)合，啟動IL-6的基因轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)對IL-6的調(diào)控［12－13］。為了確定大鼠C／EBPβ與IL-6基因啟動子的結(jié)合區(qū)域，先通過TFSearch軟件預(yù)測出IL-6基因啟動子上含圖4各截短熒光素酶報告質(zhì)粒菌液PCR鑒定Figure4PCRindentificationofdifferenttruncatedluciferasereporterplasmids20001000750500250100bpMarkerpGL3-IL-6-21422bp920bpMarkerMarker648bpMarker456bppGL3-IL-6-3pGL3-IL-6-4pGL3-IL-6-5*IL-6promoterluciferaseactivity（fold）150100500＃1～5：分別為pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2、pGL3-IL-6-3、pGL3-IL-6-4、pGL3-IL-6-5與pIRES2-EGFP-C／EBPβ共轉(zhuǎn)染組；6：pGL3-Basic組。與6組比較，＃P＜0．001；與1～4組比較，*P＜0．001（n＝3）。圖5C／EBPβ過表達(dá)對于大鼠IL-6基因啟動子（各截短）活性的影響Figure5TheeffectsofC／EBPβoverexpressionontheactivityofdifferenttruncatedratIL-6genepromoter123456·726·

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大鼠Caspase8基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與IRF-1結(jié)合位點的鑒定[J]. 單鍇,邱文,李妍,周建博,劉麗莎,趙聃,王迎偉.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2013(03)



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