發(fā)布時(shí)間：2021-01-24 13:12

　　背景:人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）,經(jīng)感染人體后可導(dǎo)致獲得性缺陷綜合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）。聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Combination Antiretroviral Therapy,cART）的運(yùn)用,可以使 HIV-1 感染者體內(nèi)的病毒復(fù)制數(shù)低于常規(guī)檢測水平線以下,但不能使其完全清除。治療HIV-1感染的主要困難就是清除這群潛伏的整合且具有復(fù)制能力的病毒儲存庫（viral reservoir）。目前對于檢測病毒儲存庫方法很多,但是各有不足,如何能更精確快速找到病毒儲存庫,本研究論文提出問題,并且在目前被視為檢測病毒儲存庫金標(biāo)準(zhǔn)的方法—體外擴(kuò)增檢測（viraloutgrowthassay,VOA）的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。由于HTV-1的生物學(xué)特性的復(fù)雜,目前尚無有效疫苗。對于HIV的研究,特別是HIV-1抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后,HIV-1感染變成慢性病,各種并發(fā)癥的研究,需要動物模型。本文基于dCas9基因激活系統(tǒng)改進(jìn)HIV-1體外擴(kuò)增檢測及利用dCas9基因激活系統(tǒng)與EcoHI... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系統(tǒng)

ＨＳＦ１反式激活結(jié)構(gòu)域融合共同形成了與ｄＣａｓ９協(xié)同作用并招募皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活??結(jié)構(gòu)域的一個(gè)激活系統(tǒng)，即ｄＣａｓ９－ＳＡＭ基因激活，從而促進(jìn)ｄＣａｓ９介導(dǎo)的基因激??活（圖１Ａ），效力高達(dá)３０００倍。此激活系統(tǒng)的關(guān)鍵是需要在激活基因的啟動子區(qū)??域?qū)ふ液线m的ｇＲＮＡ，通過Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ和同ｇＲＮＡ識別序列互補(bǔ)的ＤＮＡ序列相??互作用，把轉(zhuǎn)錄起始因子帶到相應(yīng)基因啟動子區(qū)域，啟動該基因轉(zhuǎn)錄。ＨＩＶ的啟??動子是位于病毒基因組５’端和３＇端ＬＴＲ區(qū)域（圖１Ｂ）。為了更好的篩選出最合適??的ｇＲＮＡ，根據(jù)生物信息學(xué)分析，在ＬＴＲ的正反ＤＮＡ鏈上一共設(shè)計(jì)了可能的２０??條ｇＲＮＡ?（圖１?Ｃ）進(jìn)行下一步的篩選。??Ａ?ＭＳ２?＾ＨＳＰ１?Ｂ?ＨｉＮＭ?病毒獅??－４５４?－１０５?－７８?＋１?＋９８?＋１８２??圖１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系統(tǒng)?圖１?Ｂ基于ｄＣａｓ９基因激活系統(tǒng)??構(gòu)成示意圖?能激活潛伏的ＨＩＶ示意圖??ＨＩＶ－ｓｇＲＮＡ靶位點(diǎn)??正義鏈：Ｅ?ＡＪ?Ｔ?Ｋ?Ｌ?Ｎ?０?Ｐ?Ｄ?Ｒ?Ｒａ?Ｕ５ａ??反義鏈：?ＨＣＧ?Ｓ?Ｊ?Ｂ，Ｍ?Ｑ?Ｆ??ＮＦｋＢ?ＴＡＴＡ??■■?ＳＰ?■??－５００?－４００?－３００?－２００?－１００?■■■?＋１?＋１００?＋２００??Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒ?Ｅｎｈａｎｃｅｒ?Ｃｏｒｅ??圖１?Ｃ根據(jù)ＨＩＶ?ＬＴＲ序列的正鏈和負(fù)鏈的ＤＮＡ序列設(shè)計(jì)的２０個(gè)靶位點(diǎn)示意圖??２４??

３．２高效激活ＨＩＶ的ｇＲＮＡ的篩選與驗(yàn)證??首先根據(jù)設(shè)計(jì)的２０個(gè)靶位點(diǎn)，合成了?２０條ｇＲＮＡ，分別克隆入ｌｅｎｆｇＲＮＡ??（ＭＳ２）載體中，如圖２?Ａ所示。??圖２?Ａ上ＰＣＲ鑒定２０條ｇＲＮＡ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）載體電泳圖??Ｕ?＇?６?＇?＂?３?Ｔ?Ｇ?Ｇ?＇?＊?〇?Ｕ?＇?＇?．０?Ｏ?ＱＵＯ＇ＯＵＯＯＯ－＇Ｏ?０?＂?０?＇?ａ??通過設(shè)計(jì)ＰＣＲ引物，其產(chǎn)物為５０５ｂｐ為連接入載體的成功克隆；利用Ｕ６?ｐｒｏｍｏｔｅｒ通用引物測序結(jié)果??圖２?Ａ下ｇＲＮＡ－Ｌ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）載體的測序正確圖??并用測試成功的載體分別小量包裝成慢病毒。為減少ｇＲＮＡ對ＨＩＶ的激活可??能對于每一株細(xì)胞造成的差別，直接將要用于ＶＯＡ的擴(kuò)增細(xì)胞系Ｊｕｒｋａｔ細(xì)胞系進(jìn)??行篩選。通過慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)ｄＣａｓ９－ｖｐ６４和ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦｌ細(xì)胞系，并用??潮霉素和嘌呤霉素篩選成ｊｕｒｋａｔ６４６５細(xì)胞系，然后用含有ＨＩＶ－Ｌｕｃ的假病毒顆粒??進(jìn)一步感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５細(xì)胞系，建立含有熒光素酶報(bào)告基因的Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ??細(xì)胞系。分別用包裝好的２０種ｇＲＮＡ的不同的慢病毒感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ細(xì)??胞后，４８小時(shí)進(jìn)行裂解細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性鑒定，結(jié)果如圖２?Ｂ，選取了與對??照相比（Ｚｅｒｏ，為不含ｇＲＮＡ的慢病毒感染細(xì)胞）熒光素酶活性最高的ｇＲＮＡ編??號為Ｌ和Ｏ的ｇＲＮＡ進(jìn)行驗(yàn)證。??為了驗(yàn)證篩選出的編號為Ｌ和０的ｇＲＮＡ對ＨＩＶ的激活和擴(kuò)增效率


本文編號：2997307