本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與卵泡顆粒細(xì)胞增殖的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是1993年Lin等發(fā)現(xiàn)的一種新的有活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,近年來(lái),讓生殖屆學(xué)者感興趣的是,GDNF不僅可以在外周器官中表達(dá),且有證據(jù)表明其表達(dá)量高于中樞神經(jīng)系統(tǒng),其中更是以卵巢中的表達(dá)水平由為突出。在睪丸組織中的表達(dá)亦是十分的顯著。卵巢中的神經(jīng)不僅和血管相連,也和卵泡相連接,同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)異位移植的卵巢組織迅速的長(zhǎng)出神經(jīng)纖維。GDNF在卵巢組織中高表達(dá),且分布泌尿系統(tǒng)和成年個(gè)體的卵巢中且貫穿整個(gè)胚胎發(fā)育階段,主要集中在卵泡的顆粒細(xì)胞上。小鼠GDNF的mRNA表達(dá)水平隨著卵泡的發(fā)育逐漸的變顯著,直到排卵前達(dá)到最高峰�；谏鲜銮闆r,小鼠GDNF基因蛋白主要分布于卵子和顆粒細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞上。Kawamura等人進(jìn)行了一項(xiàng)DNA微陣列分析的實(shí)驗(yàn),也證實(shí)了在小鼠中DGNF的重要作用,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明GDNF的小鼠卵巢中廣泛表達(dá),在卵丘細(xì)胞,顆粒細(xì)胞和細(xì)胞膜細(xì)胞中均有表達(dá)。無(wú)論是新生小鼠還是成年小鼠的卵巢中均有GDNF的]mRNA的表達(dá),貫穿整個(gè)的發(fā)育階段,主要集中在卵泡中的卵子的間質(zhì)細(xì)胞中,在竇卵泡的卵丘細(xì)胞,顆粒細(xì)胞和細(xì)胞膜細(xì)胞中也均有表達(dá)。從經(jīng)歷卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM)的婦女的卵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),在卵泡成熟的最后階段內(nèi)GDNF蛋白在卵巢內(nèi)的表達(dá)范圍是擴(kuò)大的,主要分布在未受刺激的的顆粒細(xì)胞中。逐步的,通過(guò)人和各種哺乳動(dòng)物中所獲得數(shù)據(jù)配對(duì),我們可以總結(jié)出GDNF及其受體的表達(dá)模式,在成年女性／雌性卵巢內(nèi)GDNF以旁分泌和自分泌的方式影響卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。雖然對(duì)于GDNF在生殖方面的研究已經(jīng)較多,但是人卵巢方面的研究卻仍然很少,有證據(jù)表明人黃素化顆粒細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)存在GDNF, GFRa-1,Ret的表達(dá),且FHS和hCG可以增加顆粒細(xì)胞中的GDNF的表達(dá),并且以旁分泌的方式促進(jìn)卵泡成熟。在卵巢組織體外培養(yǎng)的過(guò)程中,加入GDNF可以促進(jìn)卵泡的發(fā)育和成熟,然而對(duì)于GDNF作用于顆粒細(xì)胞以及卵母細(xì)胞各自的機(jī)制如何?本研究以KGN顆粒細(xì)胞和人卵母細(xì)胞為研究對(duì)象,檢測(cè)GDNF及其受體在人卵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,觀(guān)察GDNF刺激對(duì)KGN顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)所起到的作用,并初步探討其在作用機(jī)制。目的觀(guān)察(GDNF對(duì)凍融后人腔前卵泡來(lái)源的卵母細(xì)胞體外發(fā)育的作用；探討GDNF在KGN細(xì)胞增殖過(guò)程中影響,以及GDNF刺激后KGN細(xì)胞基因表達(dá)的變化,為臨床應(yīng)用提供有利的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.搜集卵巢囊腫手術(shù)患者的正常卵巢皮質(zhì),采用玻璃化冷凍的方法行冷凍處理,解凍后行酶消化法消化,消化后機(jī)械法于鏡下取始基卵泡和初級(jí)卵泡,置于FA凝膠內(nèi),GDNF刺激,選擇適當(dāng)濃度,觀(guān)察GDNF刺激后體外培養(yǎng)卵泡變化。2體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞,于6孔皿傳代后24h,行饑餓處理6h后,給予1ul含GDNF試劑至試驗(yàn)組使GDNF濃度為5ul/ml,6h后裂解細(xì)胞并提取RNA,做PCR,檢測(cè)基因變化。3.體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞,傳代入12孔皿后,行爬片處理,采用免疫組化和RT-PCR法檢測(cè)其受體GDNF家族受體酪氨酸激酶受體RET (rearranged during transfeetion)的表達(dá)。4.體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞,傳代入96孔皿后,分別給予不同濃度GDNF刺激,觀(guān)察24h、48h后做CCK-8刺激后細(xì)胞增殖情況。5.體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞,于6孔皿傳代后,試驗(yàn)組給予5ng/ml GDNF刺激,24h,48h后分別收集試驗(yàn)組和控制組液體lml,檢測(cè)2組間雌激素、孕激素變化。結(jié)果1.酶+機(jī)械法聯(lián)合分離卵泡后置于FA凝膠中,給予不同濃度的GDNF刺激,在體外培養(yǎng)6天時(shí),10ng/mlGDNF組和100ng/mlGDNF組中卵泡直徑及分泌的E2水平增長(zhǎng)顯著高于對(duì)照組和1ng/mlGDNF組(P0.05)。2.GDNF的受體蛋白R(shí)ET在顆粒細(xì)胞上有表達(dá),定位于胞核和胞漿。3.不同濃度水平的GDNF對(duì)顆粒細(xì)胞系的生長(zhǎng)影響不同：高濃度的GDNF抑制細(xì)胞增殖,低濃度的GDNF促進(jìn)細(xì)胞增殖。其中100ng/ml較控制組顯著抑制(P0.05),10ng/ml組則較控制組顯著促進(jìn)增殖(P0.05)。4.10ng/mlGDNF處理KGN細(xì)胞后對(duì)顆粒細(xì)胞的雌孕激素沒(méi)有顯著影響(P0.05)。5.FSH及其受體mRNA在10ng/mlGDNF刺激后表達(dá)有改變,表達(dá)量提高(P0.05)。結(jié)論1.在體外培養(yǎng)液中添加10 ng/ml和100ng/ml GDNF有利于促進(jìn)分離后人腔前卵泡的體外生長(zhǎng)發(fā)育,提高E2分泌功能。2. GDNF受體RET的mRNA在KGN細(xì)胞中有表達(dá),定位于胞核和細(xì)胞漿。3.10ng/mlGDNF可以更好的刺激體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞增殖,而其濃度過(guò)大可抑制細(xì)胞增殖。4.GDNF體外刺激KGN細(xì)胞,雌激素孕激素水平無(wú)顯著變化。5.GDNF體外刺激KGN細(xì)胞,可以改變其下游基因FSH受體表達(dá)的改變,增加FSH敏感性。
【關(guān)鍵詞】：GDNF KGN細(xì)胞 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R321
【目錄】：

• 摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 中英文縮略詞表12-14
• 前言14-17
• 1 材料與方法17-32
• 2 結(jié)果32-37
• 3 討論37-41
• 4 結(jié)論41-42
• 附圖42-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其在生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展48-65
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文及參加會(huì)議情況及參與課題情況66-67
• 致謝67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孫文楓;蘇迎春;孫瑩璞;郭藝紅;劉新貴;馬新想;馮雙苗;;冷凍保存對(duì)人卵巢組織雌二醇分泌功能的影響[J];生殖與避孕;2009年06期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 馬莉;凍融人卵巢組織腔前卵泡的分離及體外培養(yǎng)的研究[D];鄭州大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與卵泡顆粒細(xì)胞增殖的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：299666