發(fā)布時間：2021-01-06 07:57

　　目的:篩選特異性抗人載脂蛋白6單鏈抗體（anti-hLCN6 scFv）,并進行表達純化和活性鑒定。方法:采用RT-PCR技術(shù),用抗體可變區(qū)簡并引物,從hLCN6免疫小鼠的淋巴細胞中擴增全套V_H和V_L基因,裝配成scFv基因后將其克隆到噬菌體載體pFAB5C中,構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫。對抗體庫進行4輪富集,篩選抗hLCN6陽性scFv。經(jīng)原核表達純化后,用Western blot和間接ELISA對其活性進行鑒定。結(jié)果:篩選到2株親和力較高的陽性克隆,測序表明其序列一致。獲得了高純度的scFv抗體,其對抗原具有良好的親和力和特異性。結(jié)論:成功篩選到特異性抗hLCN6 scFv,為利用該抗體進行混合斑中的精子分離奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國免疫學雜志. 2020,36(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

抗hLCN6 scFv親和力測定

將全套VH、VL基因擴增產(chǎn)物進行電泳后,擴增出的VH基因片段約為340 bp,VL基因片段約為320 bp,與預(yù)期大小一致 (圖1A)。將全套VH、VL基因添加酶切位點及連接肽序列后,用重疊延伸PCR將重、輕鏈可變區(qū)拼接成完整的scFv基因,拼接擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后,得到1條約710 bp的片段,同預(yù)期結(jié)果相符 (圖1B)。將拼接產(chǎn)物雙酶切后與載體連接,轉(zhuǎn)化E.coli后鋪板,測定庫容為1.5×106,隨機挑取10個集落,PCR擴增鑒定重組率為90% (圖1C)。2.2 噬菌體抗體庫的篩選及陽性克隆的鑒定

表1 親和富集篩選對抗hLCN6 scFv的富集效應(yīng)Tab.1 Selective enrichment of anti-hLCN6 phage antibodies from phage display library Round Input(cfu) Output(cfu) Recovery rate(output/input) Enrichment[rate(n)/rate(1)] 1 1.0×1013 2.5×105 2.5×10-8 1 2 1.5×1012 2.0×106 1.3×10-6 52 3 2.0×1012 3.8×107 1.9×10-5 760 4 2.4×1012 7.9×107 3.3×10-5 1 3202.3 抗hLCN6 scFv的表達純化與生物學活性鑒定

【參考文獻】：
期刊論文
[1]hLCN6單克隆抗體偶聯(lián)免疫磁珠用于混合細胞中精子的分離與法醫(yī)學鑒定[J]. 陳炯,馮巍,詹飛.  生物工程學報. 2019(01)
[2]單鏈抗體的構(gòu)建及其在醫(yī)學上的應(yīng)用[J]. 汪希雅,余平.  中國病原生物學雜志. 2009(10)
[3]單鏈抗體及其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用[J]. 馬穎,鄒全明.  免疫學雜志. 2006(S1)
[4]抗p185單抗5E12Fab段基因的克隆及表達[J]. 張國民,陳宇萍,王琰,喬媛媛,安云慶.  中國免疫學雜志. 2005(12)



本文編號：2960214