本文關(guān)鍵詞：O-GlcNAc糖基化調(diào)節(jié)PKA的活性：影響學(xué)習(xí)記憶的新機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的蛋白激酶A(PKA)是一種受環(huán)腺苷酸(cAMP)激活的激酶,參與細(xì)胞內(nèi)的糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝。早期研究表明,PKA能夠通過(guò)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)參與學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程。PKA全酶由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(R)二聚體和每個(gè)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合的一個(gè)催化亞基(C)組成。PKA調(diào)節(jié)亞基在與2分子cAMP結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變,導(dǎo)致催化亞基的釋放和激活。此外,也有研究表明PKA可不依賴cAMP活化。O-GlcNAc糖基化是一種蛋白的翻譯后修飾,這一反應(yīng)過(guò)程由O連接N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(OGT)和β-N-乙酰氨基酶(OGA)所調(diào)控。本文旨在研究PKA是否受到O-GlcNAc糖基化的調(diào)控,從而探討AD患者大腦中葡萄糖攝入障礙通過(guò)下調(diào)PKA的O-GlcNAc糖基化引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙的分子機(jī)制。方法1.在HEK-293FT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OGT增加細(xì)胞O-GlcNAc糖基化水平,通過(guò)免疫沉淀的方法檢測(cè)PKA是否受到O-GlcNAc糖基化的修飾。2.在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OGT或OGA或shOGT以改變O-GlcNAc糖基化水平,然后用Western blots檢測(cè)O-GlcNAc糖基化和PKA底物——CREB的磷酸化。3.在HEK-293FT細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)PKA催化亞基α或β,同時(shí)過(guò)表達(dá)OGT,經(jīng)過(guò)免疫純化PKA催化亞基,對(duì)人源重組tau蛋白體外磷酸化,通過(guò)點(diǎn)印跡檢測(cè)tau的磷酸化水平。4.在大鼠代謝腦片中加入OGA抑制劑PUGNAc以提高O-GlcNAc糖基化水平,通過(guò)Western blot分析PKA下游底物tau在Ser214的磷酸化水平。5.饑餓小鼠使得大腦神經(jīng)元葡萄糖的攝入降低以下調(diào)o-glcnac糖基化,通過(guò)westernblot分析o-glcnac糖基化和pka下游底物磷酸化的變化。6.條件性敲除小鼠前腦神經(jīng)元ogt基因,通過(guò)westernblot分析o-glcnac糖基化、pka下游底物磷酸化、tau磷酸化、神經(jīng)元和突觸標(biāo)記物的變化。7.小鼠側(cè)腦室注射don抑制o-glcnac糖基化,檢測(cè)下調(diào)o-glcnac糖基化對(duì)小鼠條件性恐懼相關(guān)記憶的影響,并通過(guò)westernblot分析海馬o-glcnac糖基化、pka下游底物磷酸化的變化。8.通過(guò)慢性缺血模型,在ad模型/野生型小鼠中觀察神經(jīng)元長(zhǎng)期葡萄糖攝入降低對(duì)o-glcnac糖基化、pka底物磷酸化和短期記憶、場(chǎng)景記憶的影響。結(jié)果1.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提示pka催化亞基α和β受到o-glcnac糖基化的修飾,過(guò)表達(dá)ogt使得pkac的糖基化水平增加。2.過(guò)表達(dá)ogt上調(diào)o-glcnac糖基化水平,使得creb磷酸化水平增加、過(guò)表達(dá)oga或shogt下調(diào)o-glcnac糖基化,使得creb的磷酸化水平下降。3.過(guò)表達(dá)ogt上調(diào)o-glcnac糖基化修飾,使得pkac催化tau磷酸化的激酶活性增加。4.在大鼠代謝腦片培養(yǎng)中,上調(diào)o-glcnac水平,tau蛋白在pka磷酸化位點(diǎn)ser214的磷酸化增加,而非pka位點(diǎn)thr205的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變。5.饑餓使得小鼠大腦中o-glcnac糖基化水平下降,伴隨著tau在ser214和creb在ser133的磷酸化水平降低、tau在thr205的磷酸化水平增加。6.特異性敲除小鼠神經(jīng)元ogt基因后,小鼠前腦o-glcnac糖基化水平下降,伴隨著tau在ser214、creb在ser133磷酸化水平下降和tau在thr205磷酸化水平的增加,以及神經(jīng)元和突觸標(biāo)記物表達(dá)下降。7.側(cè)腦室注射don使得小鼠腦中o-glcnac糖基化水平降低、tau在ser214、creb在ser133的磷酸化水平降低,小鼠在條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中對(duì)環(huán)境和聲音刺激的記憶力下降。8.慢性缺血使得野生型小鼠及3×Tg-AD模型小鼠探索能力上升,短期記憶和場(chǎng)景記憶力削弱。結(jié)論1.PKA催化亞基α和β受O-GlcNAc糖基化修飾。2.O-GlcNAc糖基化修飾影響PKA的活性。上調(diào)O-GlcNAc糖基化水平,使得PKA的活性增加,PKA催化的下游底物磷酸化水平增加;下調(diào)O-GlcNAc水平,使得PKA催化的下游底物的磷酸化水平降低。3.下調(diào)O-GlcNAc糖基化使得小鼠的認(rèn)知功能和記憶力水平下降。
【關(guān)鍵詞】：蛋白激酶A O-GlcNAc糖基化 CREB tau 慢性缺血
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R338
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一章 緒論12-15
• 第二章 材料與方法15-26
• 2.1 材料15-20
• 2.1.1 質(zhì)粒15
• 2.1.2 細(xì)胞15
• 2.1.3 動(dòng)物15-16
• 2.1.4 試劑16-18
• 2.1.5 抗體18-19
• 2.1.6 儀器19-20
• 2.2 方法20-25
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 2.2.2 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染20-21
• 2.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡21
• 2.2.4 免疫沉淀和免疫共沉淀21-22
• 2.2.5 點(diǎn)印記22-23
• 2.2.6 大腦切片培養(yǎng)23
• 2.2.7 側(cè)腦室注射（ICV）23-24
• 2.2.8 條件性恐懼24
• 2.2.9 小鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎慢性腦缺血模型24
• 2.2.10 高架十字迷宮24-25
• 2.2.11 礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)25
• 2.2.12 Morris水迷宮25
• 2.2.13 新物體識(shí)別25
• 2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)25-26
• 第三章 結(jié)果26-45
• 3.1 PKA催化亞基受到O-GlcNAc糖基化的修飾26-27
• 3.2 改變O-GlcNAc糖基化水平影響CREB磷酸化水平27-28
• 3.3 O-GlcNAc糖基化使得PKA-C激酶活性增加28-31
• 3.4 藥物處理提高糖基化水平對(duì)PKA催化亞基活性的影響31-32
• 3.5 饑餓導(dǎo)致的O-GlcNAc糖基化水平降低下調(diào)PKA催化活性32-33
• 3.6 敲除小鼠前腦神經(jīng)元OGT對(duì)PKA催化底物磷酸化的影響33-37
• 3.6.1 前腦神經(jīng)元OGT敲除小鼠，O-GlcNAc糖基化水平下降，，PKA底物磷酸化下降33-35
• 3.6.2 前腦神經(jīng)元OGT敲除小鼠大腦內(nèi)，tau磷酸化水平變化35
• 3.6.3 前腦神經(jīng)元OGT敲除小鼠大腦內(nèi)，神經(jīng)元和突觸標(biāo)記物下降35-37
• 3.7 DON下調(diào)小鼠大腦糖基化水平對(duì)其學(xué)習(xí)記憶行為的影響37-40
• 3.7.1 藥物抑制小鼠大腦糖基化水平，削弱了恐懼相關(guān)記憶37-38
• 3.7.2 DON抑制小鼠大腦糖基化水平、降低PKA催化活性38-40
• 3.8 小鼠慢性大腦缺血的行為學(xué)研究40-45
• 3.8.1 慢性缺血對(duì)小鼠探索性行為的影響40-42
• 3.8.2 慢性缺血對(duì)小鼠短期記憶影響42-43
• 3.8.3 慢性缺血對(duì)小鼠場(chǎng)景記憶影響43-44
• 3.8.4 慢性缺血對(duì)小鼠蛋白O-GlcNAc糖基化和磷酸化水平的影響44-45
• 第四章 討論45-49
• 第五章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 綜述54-72
• 綜述參考文獻(xiàn)63-72
• 英文縮寫詞表72-73
• 在攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表的論文與參加的項(xiàng)目73-74
• 致謝74

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉華東;陳永湘;趙玉芬;李艷梅;;O-GlcNAc修飾研究進(jìn)展[J];中國(guó)科技論文在線;2007年08期

2 叢琦;顧玉超;于文功;;蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾的檢測(cè)技術(shù)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2012年06期

3 覃培斌;董潤(rùn)安;彭博;應(yīng)萬(wàn)濤;錢小紅;;O-GlcNAc糖蛋白/糖肽的分離富集方法[J];生命的化學(xué);2013年02期

4 王s

本文編號(hào)：295499