發(fā)布時間：2017-04-09 09:23

  本文關鍵詞：通用型H1N1甲型流感病毒疫苗的研發(fā)及基于Vero細胞的高產(chǎn)流感疫苗株的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感病毒是造成歷史上多次流感大流行的病原體,也是引起季節(jié)性流行性感冒發(fā)生的病原體。流感病毒屬于正黏病毒科,分為甲、乙、丙三型,其中甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是造成人和多種動物感染的主要病原體。在全世界范圍內(nèi),每年都會有大量易感人群因感染流感病毒發(fā)病甚至死亡。由于流感病毒變異速度很快,流感疫苗需要逐年更新,因此具有廣譜保護效果的通用流感疫苗成為目前流感疫苗研究的方向和熱點。H1N1亞型流感病毒是人群中造成季節(jié)性流行性感冒的主要病原體之一。H1N1亞型人流感病毒的分離株眾多、不同分離株序列差異較大,普通的季節(jié)性流感疫苗不能對所有毒株都產(chǎn)生保護作用。我們實驗室前期通過“共有序列+保守表位”的方式設計出一條針對H1N1亞型流感病毒的HA蛋白通用序列——CH1-1。在本實驗中,我們用DNA疫苗的方式在小鼠體內(nèi)檢測了CH1-1所誘導的體液免疫應答以及細胞免疫應答,并對其廣譜反應性做以評價。結(jié)果表明接種了p CH1-1的小鼠血清對NC99和FM47病毒有中和活性。免疫小鼠的T細胞可產(chǎn)生對SC09、NC99和FM47幾個代表株病毒抗原的細胞免疫反應。為了同時獲得對SC09有中和活性的抗體,我們在DNA免疫組合中加入了表達SC09的HA的基因,p CH-1和p SC09-HA兩種質(zhì)�；旌厦庖咝∈蟆５玫降拿庖哐鍖Π⊿C09在內(nèi)的三株病毒都產(chǎn)生很強的交叉中和活性;SC09、NC99、FM47三種抗原體外刺激T細胞也發(fā)現(xiàn),細胞上清中IFNγ含量都有很大提高。混合質(zhì)粒免疫過的小鼠能抵抗致死劑量SC09、NC99和FM47等病毒的攻擊,病毒攻毒免疫小鼠的肺臟病變明顯減弱,攻毒14天后小鼠肺內(nèi)未檢測到病毒殘留,這說明兩種抗原的組合能誘導對許多種H1N1病毒的廣譜免疫應答。用CH1-1基因替換PR8病毒的HA基因構(gòu)建的重組病毒株PR8-CH1-1是一株天然的弱毒株。PR8-CH1-1滴鼻免疫小鼠后用SC09和NC99兩株病毒檢測保護效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有免疫過的小鼠在用致死劑量的兩株病毒攻毒后均得到很好的保護,死亡率為0,肺臟只有輕微病變,攻毒14天后小鼠肺內(nèi)未檢測到病毒殘留。這說明以PR8-CH1-1作為減毒活疫苗能誘導對許多種H1N1病毒的廣譜保護性免疫應答。甲型流感病毒一直威脅人類健康,接種疫苗是預防甲型流感病毒感染的有效途徑。哺乳動物二倍體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是生產(chǎn)甲型流感疫苗的新一代培養(yǎng)介質(zhì)。在前期工作中通過病毒基因組改造,我們已經(jīng)獲得Vero細胞高產(chǎn)的流感病毒疫苗骨架株,本研究將基于該Vero細胞高產(chǎn)骨架株構(gòu)建H7N9甲型流感病毒疫苗株,研究和檢驗該高產(chǎn)疫苗骨架株是否支持新近流行的H7N9亞型流感病毒疫苗株在Vero細胞中的生長,為應對人感染H7N9病毒提供細胞介質(zhì)疫苗候選株。首先通過甲型流感病毒反向遺傳學技術(shù),將H7N9亞型流行株的HA和NA基因(2條編碼病毒表面蛋白的基因)與Vero細胞高產(chǎn)疫苗骨架株PR8-4mut的PB1、PB2、PA、NP、M、NS基因(6條編碼病毒內(nèi)部蛋白的基因),通過6+2重組法拯救出4mut-H7N9病毒。同時拯救對照病毒PR8-H7N9(HA、NA來自于H7N9,6條編碼病毒內(nèi)部蛋白的基因來自于野生型PR8病毒)。通過生長曲線和空斑形態(tài)等病毒學方法比較PR8-H7N9和4mut-H7N9兩株病毒在Vero細胞上的生長性狀;通過免疫印跡和考馬斯亮藍染色檢測4mut-H7N9病毒產(chǎn)量最高時間點時,PR8-H7N9和4mut-H7N9兩株病毒的特定蛋白或大部分蛋白的產(chǎn)量差異。對比兩株病毒的生長曲線發(fā)現(xiàn),感染后72小時4mut-H7N9的病毒滴度比PR8-H7N9滴度高約3000倍;空斑實驗顯示,培養(yǎng)48小時后,4mut-H7N9在Vero細胞上形成直徑約1毫米的空斑,而PR8-H7N9只能形成針孔大小的空斑;考馬斯亮藍染色比較兩株病毒總蛋白含量表明,兩株病毒以相同MOI感染Vero細胞后72小時收集的上清中,4mut-H7N9各病毒蛋白組分含量均遠高于PR8-H7N9;用免疫印跡法檢測兩株病毒上清中PA、NP和M1蛋白的相對含量得到了與考馬斯亮藍染色相似的結(jié)果;4mut-H7N9病毒沒有改變胰酶依賴性保證了該高產(chǎn)疫苗株的安全性。因此,通過反向遺傳學技術(shù)將PR8-4mut的6條內(nèi)部基因加上H7N9的HA和NA基因構(gòu)建的4mut-H7N9能夠極大地提高病毒在Vero細胞中的增殖速度,可作為以Vero細胞為生產(chǎn)介質(zhì)的H7N9高產(chǎn)疫苗備選株。
【關鍵詞】：流感病毒 通用疫苗 H7N9 Vero細胞 高產(chǎn)疫苗株
【學位授予單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392;S855.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 緒論11-29
• 1.1 流感病毒的分類11-12
• 1.2 流感病毒粒子的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 流感病毒的復制周期13-25
• 1.3.1 唾液酸是甲型流感病毒的細胞表面受體13-14
• 1.3.2 病毒侵入14-15
• 1.3.3 從早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體15
• 1.3.4 vRNPs的脫殼15-16
• 1.3.5 vRNP的入核轉(zhuǎn)運16-18
• 1.3.6 vRNP的整體結(jié)構(gòu)和特性18-19
• 1.3.7 病毒RNA聚合酶19
• 1.3.8 流感病毒的啟動子19-20
• 1.3.9 轉(zhuǎn)錄20
• 1.3.10 復制20-21
• 1.3.11 新合成病毒蛋白的入核轉(zhuǎn)運21
• 1.3.12 復制的機制：順式作用和反式作用的聚合酶21-23
• 1.3.13 新合成vRNPs的出核轉(zhuǎn)運23-24
• 1.3.14 胞質(zhì)運輸24-25
• 1.3.15 病毒組裝和釋放25
• 1.4 抗原漂變和抗原轉(zhuǎn)變25-26
• 1.5 流感病毒疫苗的研究現(xiàn)狀26-29
• 1.5.1 流感疫苗的現(xiàn)狀26-27
• 1.5.2 新型流感疫苗27-29
• 第二章 通用型H1N1 甲型流感病毒疫苗的研發(fā)29-52
• 2.1 研究背景29-33
• 2.2 材料和方法33-40
• 2.2.1 材料33-34
• 2.2.2 方法34-40
• 2.3 結(jié)果40-50
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pCH1-1 在真核細胞中的表達40-41
• 2.3.2 共有序列CH1-1 的廣譜效果41-43
• 2.3.3 DNA疫苗組合誘導的交叉免疫應答43-44
• 2.3.4 DNA疫苗組合能誘導交叉保護性免疫應答44-46
• 2.3.5 重組病毒PR8-CH1-1 是弱毒株46
• 2.3.6 重組病毒PR8-CH1-1 能誘導交叉保護性免疫應答46-50
• 2.4 討論50-52
• 第三章 基于Vero細胞的高產(chǎn)流感疫苗株的制備52-68
• 3.1 研究背景52-54
• 3.2 材料和方法54-60
• 3.2.1 材料54-55
• 3.2.2 方法55-60
• 3.3 結(jié)果60-65
• 3.3.1 pHW2000-H7N9-HA 和 pHW2000-H7N9-NA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定60-61
• 3.3.2 PR8-H7N9 和 4mut-H7N9 病毒的拯救61-62
• 3.3.3 4mut-H7N9 病毒在 Vero 細胞上的生長速度比 PR8-H7N9 病毒更快62-63
• 3.3.4 Vero 細胞適應性突變沒有提升 4mut-H7N9 病毒的毒力63-64
• 3.3.5 等量細胞培養(yǎng)出的 4mut-H7N9 病毒蛋白含量高于PR8-H7N964-65
• 3.4 結(jié)論65-68
• 致謝68-69
• 參考文獻69-81

【共引文獻】

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