艱難梭菌Clostridioesdifficile是一種革蘭氏陽性、產芽孢、專性厭氧細菌,是醫(yī)院相關性腹瀉的主要病原體。近年來,隨著強毒株的出現(如核糖體027型),其流行性與致死率逐年上升,因此對艱難梭菌生理、生化特征及致病機制的研究受到廣泛重視。艱難梭菌生理、生化特征及致病機制研究又以建立其穩(wěn)定、高效的基因編輯方法為必要前提。借助基因編輯工具,研究者可以擾動艱難梭菌核心生物學過程,在分子水平研究其分子致病機制。如Clos Tron技術在艱難梭菌毒素A (Toxin A)和毒素B (Toxin B)與其致病力關系的研究中起到了關鍵作用。文中以時間為主線綜述了艱難梭菌基因編輯技術的發(fā)展歷程和最新進展,并對艱難梭菌基因編輯技術未來的研究方向進行展望。 

【文章來源】：生物工程學報. 2020年02期 北大核心

【文章頁數】：16 頁

【部分圖文】：

艱難梭菌基因編輯技術的不同發(fā)展階段[10-11,16,19,23-30]

2002年，Purdy等發(fā)現了CD630內源質粒pCD6，該質粒大小為6 829 bp,GC含量為24.5%，包含5個開放閱讀框(Open reading frame,orf):orfA、orfB、orfC、orfD和orfE(圖2)[23,33]。orfA大小為3 994 bp，編碼復制蛋白，其下游有一段重復序列，可驅動質粒在CD630中復制。orfB編碼未知功能肽段且不是復制必需的。orfC和ofrD也位于復制區(qū)域，但是功能未知。orfE編碼長度為187個氨基酸的蛋白質，與胞壁酰五肽羧肽酶有相似性，推測參與細胞壁的生物合成。Purdy等使用pCD6復制子(orfA)構建了pMTL9301質粒，該質粒在艱難梭菌中的轉化效率較高(5.7×10–5轉化子/質粒供體)。連續(xù)傳代實驗表明，p MTL9301在艱難梭菌中可以穩(wěn)定復制。在無抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)32次傳代后，僅有8%的克隆丟失質粒。相比之下，pMTL9401(pB102復制子)在同樣的培養(yǎng)條件下，有96%的菌體丟失了質粒[23]。因此pCD6復制子被用于構建大腸桿菌-艱難梭菌穿梭質粒[34]。該質�？稍诖竽c桿菌(CA434)協(xié)助質粒(Helper plasmid)的幫助下，通過結合轉移的方式進入艱難梭菌中，并可在其中穩(wěn)定復制[23]。1.3 突破限制性內切酶屏障，建立外源質粒轉化方法

2007年，梭菌基因編輯的先驅Minton研究組，Heap等將來源于乳酸球菌ltrB基因的Ll.ltrB二型內含子與穿梭質粒融合，開發(fā)了首個能夠在梭菌中通用的基因失活工具——ClosTron，該系統(tǒng)借助二型內含子可重編碼的“歸巢(Retrohoming)”效應[44-45]，成功地在艱難梭菌、丙酮丁醇梭菌和生孢梭菌C.sporogenes等菌株中實現了靶向基因失活(圖4)[12,24-27]。該研究組在接下來的工作中進一步改進了ClosTron系統(tǒng)，如在ClosTron質粒上加入了轉座激活篩選基因(Retrotranspositionactivated marker,RAM)，從而提高了突變株的篩選效率[46]；建立了免費的引物設計網站http://clostron.com，提高打靶效率；在質粒載體構建過程中加入藍白斑篩選標記，從而提高載體構建和篩選的效率[25]。ClosTron技術可在10–14 d內快速獲得靶基因失活突變株，因此極大地提高了梭菌屬細菌突變株構建效率。該技術目前仍是艱難梭菌突變株構建的主要工具，并被深度開發(fā)為艱難梭菌必需基因檢測手段[47]。2010年Minton研究組發(fā)表了使用ClosTron技術對艱難梭菌毒素基因的研究結果，他們發(fā)現Toxin A和Toxin B都具有細胞毒性，并都能夠單獨在倉鼠模型中誘導腸道疾病的發(fā)生[15]。


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