本文關(guān)鍵詞：B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體的篩選及其活性測(cè)定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肉毒毒素是肉毒桿菌產(chǎn)生的一種高分子蛋白神經(jīng)毒素,是目前已知在天然與合成毒素中毒性最強(qiáng)的一種生物毒素。它主要是抑制乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而引起肌肉麻痹,嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡。B型肉毒毒素在歐洲被稱為Neurobloc,也是導(dǎo)致人類肉毒中毒的一種類型。目前有關(guān)B型肉毒毒素的研究較少,還沒有B型肉毒中毒的救治藥物和治療方法。噬菌體抗體庫(kù)Tomlinson I+J是由英國(guó)劍橋MRC HGMP(Human Genome Mapping)資源中心建立的,文庫(kù)擁有1×108單鏈抗體scFv基因片段,庫(kù)容量大,多樣性高,在未知所篩選物克隆序列的情況下,利用這兩個(gè)文庫(kù),可篩選得到高度親和力的特異性抗體。因此,這將會(huì)為B型肉毒毒素中毒研制特效藥及開發(fā)B型肉毒毒素抗體制劑奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。鑒于肉毒毒素輕鏈在肉毒毒素中毒中的核心作用,本研究通過誘導(dǎo)表達(dá)B型肉毒毒素輕鏈蛋白,得到純度達(dá)90%的蛋白。以此為抗原通過噬菌體抗體庫(kù)Tomlinson I+J四輪富集篩選,得到數(shù)幾十株陽(yáng)性菌株,加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)抗B型肉毒毒素輕鏈的人源單鏈抗體�？贵w活性的有無(wú)或大小至關(guān)重要,本實(shí)驗(yàn)采用的是綠色熒光蛋白標(biāo)記法。GFP即綠色熒光蛋白,在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線下激發(fā),能產(chǎn)生綠色熒光,是一種活體報(bào)告蛋白。人工合成了SV蛋白的基因,其表達(dá)的蛋白質(zhì)序列包含了SNAP25和VAMP中各型肉毒毒素的切割位點(diǎn),將綠色熒光蛋白基因(GFP)與SV基因相連成重組基因GFP-SV,并克隆入pET-28a表達(dá)載體中,表達(dá)并純化融合蛋白GFP-SV。利用GFP-SV作為底物,根據(jù)綠色熒光蛋白的熒光數(shù)值變化測(cè)定Bont-B抗體的活性。通過人源化噬菌體庫(kù)篩選及活性檢測(cè),獲得了三株具有Bont-B中和活性的抗體細(xì)胞株,其親和常數(shù)分別為4H(4.38±0.445)×105L/mol,7A(5.35±0.903)×105L/mol,7B(1.146±0.525)×106L/mol。
【關(guān)鍵詞】：B型肉毒毒素輕鏈 噬菌體抗體庫(kù)I+J 抗體 GFP 活性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-9
• 第一篇 綜述9-17
• 第一章 肉毒毒素9-14
• 1.1 肉毒梭菌9
• 1.2 肉毒毒素9-10
• 1.3 B型肉毒毒素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)10-11
• 1.4 B型肉毒毒素的輕鏈11
• 1.5 肉毒毒素作用機(jī)理11-13
• 1.6 SNARE蛋白復(fù)合體13-14
• 第二章 噬菌體展示技術(shù)14-17
• 2.1 概念14
• 2.2 噬菌體展示技術(shù)的原理14
• 2.3 噬菌體展示系統(tǒng)14-15
• 2.4 從噬菌體抗體庫(kù)中篩選特異性抗體15
• 2.5 噬菌體抗體庫(kù)的篩選方法15-16
• 2.6 人源化單克隆抗體庫(kù)I+J16-17
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容17-49
• 第一章B型肉毒毒素輕鏈蛋白的表達(dá)與純化17-22
• 1.1 材料17-19
• 1.2 方法19-20
• 1.3 結(jié)果20-21
• 1.4 討論21
• 1.5 小結(jié)21-22
• 第二章 篩選B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體22-29
• 2.1 材料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.3 結(jié)果27-28
• 2.4 討論28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第三章 重組質(zhì)粒GFP-SV的構(gòu)建及其蛋白的表達(dá)純化29-43
• 3.1 材料29-31
• 3.2 方法31-38
• 3.3 結(jié)果38-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第四章 抗體的活性檢測(cè)及其親和常數(shù)的測(cè)定43-49
• 4.1 材料43-44
• 4.2 方法44-45
• 4.3 結(jié)果45-47
• 4.4 討論47-48
• 4.5 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 附錄A53-54
• 附錄B54
• 附錄C54-58
• 作者簡(jiǎn)介58-59
• 致謝59

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：293069