本文關(guān)鍵詞：B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體的篩選及其活性測定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肉毒毒素是肉毒桿菌產(chǎn)生的一種高分子蛋白神經(jīng)毒素,是目前已知在天然與合成毒素中毒性最強(qiáng)的一種生物毒素。它主要是抑制乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而引起肌肉麻痹,嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡。B型肉毒毒素在歐洲被稱為Neurobloc,也是導(dǎo)致人類肉毒中毒的一種類型。目前有關(guān)B型肉毒毒素的研究較少,還沒有B型肉毒中毒的救治藥物和治療方法。噬菌體抗體庫Tomlinson I+J是由英國劍橋MRC HGMP(Human Genome Mapping)資源中心建立的,文庫擁有1×108單鏈抗體scFv基因片段,庫容量大,多樣性高,在未知所篩選物克隆序列的情況下,利用這兩個文庫,可篩選得到高度親和力的特異性抗體。因此,這將會為B型肉毒毒素中毒研制特效藥及開發(fā)B型肉毒毒素抗體制劑奠定堅實的基礎(chǔ)。鑒于肉毒毒素輕鏈在肉毒毒素中毒中的核心作用,本研究通過誘導(dǎo)表達(dá)B型肉毒毒素輕鏈蛋白,得到純度達(dá)90%的蛋白。以此為抗原通過噬菌體抗體庫Tomlinson I+J四輪富集篩選,得到數(shù)幾十株陽性菌株,加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)抗B型肉毒毒素輕鏈的人源單鏈抗體�？贵w活性的有無或大小至關(guān)重要,本實驗采用的是綠色熒光蛋白標(biāo)記法。GFP即綠色熒光蛋白,在藍(lán)色波長范圍的光線下激發(fā),能產(chǎn)生綠色熒光,是一種活體報告蛋白。人工合成了SV蛋白的基因,其表達(dá)的蛋白質(zhì)序列包含了SNAP25和VAMP中各型肉毒毒素的切割位點,將綠色熒光蛋白基因(GFP)與SV基因相連成重組基因GFP-SV,并克隆入pET-28a表達(dá)載體中,表達(dá)并純化融合蛋白GFP-SV。利用GFP-SV作為底物,根據(jù)綠色熒光蛋白的熒光數(shù)值變化測定Bont-B抗體的活性。通過人源化噬菌體庫篩選及活性檢測,獲得了三株具有Bont-B中和活性的抗體細(xì)胞株,其親和常數(shù)分別為4H(4.38±0.445)×105L/mol,7A(5.35±0.903)×105L/mol,7B(1.146±0.525)×106L/mol。
【關(guān)鍵詞】：B型肉毒毒素輕鏈 噬菌體抗體庫I+J 抗體 GFP 活性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-9
• 第一篇 綜述9-17
• 第一章 肉毒毒素9-14
• 1.1 肉毒梭菌9
• 1.2 肉毒毒素9-10
• 1.3 B型肉毒毒素結(jié)構(gòu)特點10-11
• 1.4 B型肉毒毒素的輕鏈11
• 1.5 肉毒毒素作用機(jī)理11-13
• 1.6 SNARE蛋白復(fù)合體13-14
• 第二章 噬菌體展示技術(shù)14-17
• 2.1 概念14
• 2.2 噬菌體展示技術(shù)的原理14
• 2.3 噬菌體展示系統(tǒng)14-15
• 2.4 從噬菌體抗體庫中篩選特異性抗體15
• 2.5 噬菌體抗體庫的篩選方法15-16
• 2.6 人源化單克隆抗體庫I+J16-17
• 第二篇 研究內(nèi)容17-49
• 第一章B型肉毒毒素輕鏈蛋白的表達(dá)與純化17-22
• 1.1 材料17-19
• 1.2 方法19-20
• 1.3 結(jié)果20-21
• 1.4 討論21
• 1.5 小結(jié)21-22
• 第二章 篩選B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體22-29
• 2.1 材料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.3 結(jié)果27-28
• 2.4 討論28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第三章 重組質(zhì)粒GFP-SV的構(gòu)建及其蛋白的表達(dá)純化29-43
• 3.1 材料29-31
• 3.2 方法31-38
• 3.3 結(jié)果38-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第四章 抗體的活性檢測及其親和常數(shù)的測定43-49
• 4.1 材料43-44
• 4.2 方法44-45
• 4.3 結(jié)果45-47
• 4.4 討論47-48
• 4.5 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 附錄A53-54
• 附錄B54
• 附錄C54-58
• 作者簡介58-59
• 致謝59

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;單次多水平肉毒毒素A治療與外科治療的異同[J];中國臨床康復(fù);2002年15期

2 陳敏;美國用A型肉毒毒素美容的宣傳降溫[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2003年01期

3 朱延紅;路平;;A型肉毒毒素的臨床應(yīng)用[J];延安大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2004年02期

4 趙丹;A型肉毒毒素臨床新用途[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2005年15期

5 劉曉燕;肉毒毒素與美容偶聯(lián)的應(yīng)用與思考[J];中國實用美容整形外科雜志;2005年01期

6 宋寧靜;;肉毒毒素美容療法[J];皮膚病與性病;2006年01期

7 ;A型肉毒毒素臨床應(yīng)用新進(jìn)展學(xué)習(xí)班通知[J];全科醫(yī)學(xué)臨床與教育;2006年05期

8 潘勇;韓巖;楊力;郭樹忠;;B型肉毒毒素在美容領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J];中國美容整形外科雜志;2006年06期

9 許波;郭俊;程鵬遠(yuǎn);;A型肉毒毒素在頭痛治療中的研究進(jìn)展[J];國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2007年04期

10 王蓓蓓;張晨;王志軍;;注射A型肉毒毒素的并發(fā)癥[J];中國美容整形外科雜志;2008年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李吉平;徐靜;劉琳娜;孫玉成;劉文森;萬家余;高宏偉;;高效液相色譜法檢測肉毒毒素A方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物毒物學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 趙辨;;肉毒毒素在美容皮膚病學(xué)中的應(yīng)用[A];2002中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2002年

3 萬新華;Kevin Dat Vuong;Joseph Jankovic;;B型肉毒毒素治療運(yùn)動障礙病及多汗癥的臨床觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 盧振和;謝長春;高崇榮;;A型肉毒毒素注射治療頭痛初步觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會疼痛學(xué)分會第六屆年會論文摘要[C];2005年

5 程紅;王莉波;藺彬彬;張晶;;A型肉毒毒素不良反應(yīng)的治療與護(hù)理[A];中國美容與整形醫(yī)師大會論文匯編[C];2005年

6 燕鐵斌;;A型肉毒毒素臨床應(yīng)用及操作流程[A];2011年浙江省物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)學(xué)術(shù)年會暨康復(fù)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2011年

7 蘭月;竇祖林;胡昔權(quán);丘衛(wèi)紅;;A型肉毒毒素對腦損傷后痙攣上肢的治療應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

8 竇祖林;燕鐵斌;;不同定位方法下的肉毒毒素注射[A];廣東省康復(fù)醫(yī)學(xué)會、廣東社會學(xué)會健康研究專業(yè)委員會2007年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

9 董桂霞;;眼科患者對A型肉毒毒素注射認(rèn)知情況調(diào)查及護(hù)理對策[A];中華護(hù)理學(xué)會全國腫瘤護(hù)理新進(jìn)展研討會論文匯編[C];2012年

10 凌影;梁堅;喻冰菲;林泉;梁楊;;A型肉毒毒素治療咬肌肥大的療效觀察[A];第七屆中國醫(yī)師協(xié)會美容與整形醫(yī)師大會論文集[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 鐘可芬;A型肉毒毒素監(jiān)管收緊[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2008年

2 王蔭椿 韓義貞;A型肉毒毒素可治50余種病癥[N];健康報;2002年

3 記者　郭兆鋒;國產(chǎn)肉毒毒素不向美容機(jī)構(gòu)出售[N];中國消費者報;2006年

4 王丹;A型肉毒毒素列入毒性藥品管理[N];大眾衛(wèi)生報;2008年

5 記者 任麗梅;我國將A型肉毒毒素列入毒性藥品管理[N];中國改革報;2008年

6 王丹;A型肉毒毒素列入毒性藥品管理[N];健康報;2008年

7 湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 段小娟;淺談A型肉毒毒素[N];大眾衛(wèi)生報;2002年

8 湖北省天門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科主任醫(yī)師 楊小華;肉毒毒素也可治療肌肉痙攣[N];健康報;2013年

9 徐錚奎;肉毒毒素治療中風(fēng)后遺癥[N];中國醫(yī)藥報;2004年

10 供稿/《走近醫(yī)學(xué)》;肉毒毒素除皺危險大[N];北京科技報;2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 段晨旺;A型肉毒毒素在肌皮瓣擴(kuò)張中的應(yīng)用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

2 楊雄;A型肉毒毒素治療良性前列腺增生癥的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2011年

3 劉玉生;肌內(nèi)注射曲安奈德及肉毒毒素誘導(dǎo)兔咬肌萎縮試驗及臨床研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 鮑世威;A型肉毒毒素在額部皮膚軟組織擴(kuò)張中的應(yīng)用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

5 史晶;肉毒毒素與蛋白受體相互作用的分子基礎(chǔ)及其應(yīng)用的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

6 楊秀清;抗B型肉毒毒素鼠源中和抗體快速制備及其免疫學(xué)活性的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

7 溫靜;內(nèi)鏡下注射A型肉毒毒素對內(nèi)鏡下粘膜剝離術(shù)后食管狹窄的預(yù)防與治療[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2014年

8 劉建軍;A型肉毒毒素治療腦癱兒童痙攣的最佳劑量選擇研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2007年

9 于蕊;A型肉毒毒素人源性中和抗體的制備[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

10 周曉東;A型肉毒毒素化學(xué)去神經(jīng)及傳統(tǒng)手術(shù)去神經(jīng)比較，肌肉游離移植為主的方法綜合治療面癱的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究A型肉毒毒素面肌痙攣治療臨床應(yīng)用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 俞力夫;A型肉毒毒素注射對上中面部年輕化作用的臨床研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

2 劉博一;應(yīng)用A型肉毒毒素改善面下部軟組織輪廓的臨床觀察[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

3 李玉潔;B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體的篩選及其活性測定[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 韋耀;A型肉毒毒素（BoNT/A）表位多肽單克隆抗體的制備及其效價評定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

5 劉昊;基于底物構(gòu)象識別的A型肉毒毒素毒力分析系統(tǒng)的建立[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

6 詹玉華;A型肉毒毒素結(jié)合管型支具對腦卒中后馬蹄內(nèi)翻足的治療作用[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

7 康彥;毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測分析肉毒毒素A活性的研究[D];華中科技大學(xué);2007年

8 毛敏;A型肉毒毒素治療前列腺疾病的研究進(jìn)展[D];蘭州大學(xué);2009年

9 陳敏;A型肉毒毒素肌內(nèi)注射對大鼠腓腸肌組織形態(tài)及肌球蛋白重鏈組成的影響[D];浙江大學(xué);2007年

10 劉志佳;肉毒毒素中和抗體的制備以及快速檢驗診斷方法的建立和應(yīng)用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：B型肉毒毒素輕鏈蛋白特異性抗體的篩選及其活性測定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：293069