質(zhì)粒是研究細菌、病毒和真核生物細胞內(nèi)遺傳信息和通路異質(zhì)性表達的有用工具。隨著分子生物學技術日益發(fā)展,已經(jīng)有許多方法可用于體外、體內(nèi)質(zhì)粒克�。ㄈ缑盖忻高B、PCR、體外重組以及體內(nèi)重組等）,甚至大片段克隆也不再是難題。常用的酶切法受限于酶切位點的存在與否及唯一性,添加酶切位點會引入的額外序列與DNA序列復雜性（如DNA片段過大、序列堿基分布及含量等）相關的擴增困難,以及應用于構建質(zhì)粒文庫時的操作復雜、耗時長。重組技術一定程度上解決上述問題。重組技術是一種基于核酸同源重組原理,利用噬菌體重組蛋白促進寡核苷酸或線性DNA介導的體內(nèi)同源重組技術,已廣泛應用于質(zhì)粒、細菌人工染色體質(zhì)粒和多種原核生物基因組DNA的改造,包括堿基突變、缺失或插入。鑒于其重組效率相對較低,需要添加篩選標記（如抗生素）來增加重組效率,而后去掉篩選標記則需利用兩步法或引入序列特異性重組酶切除抗性標簽（抗性基因兩邊有同向的兩個短的DNA序列可以被特定的重組酶識別）,切除后仍會留下一個短的能夠被重組酶識別的DNA序列,這種重組操作更復雜且耗時長,很難得到一個真正的無痕突變株。此外,重組質(zhì)粒形成多聚體形式或是同一細胞內(nèi)重組質(zhì)粒與親... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１重組的模型圖［６］??

意思的發(fā)現(xiàn)是ＣＲＩＳＰＲ序列中許多間隔序列是來源于質(zhì)粒和發(fā)現(xiàn)ＣＲＩＳＰＲ位點是可以轉(zhuǎn)錄的［２７］，而且推測ｃａｓ基因編碼酶結(jié)構域［２４，２６，２８，２９］，所以綜合起來推測〇１１３？１＾３８是一個ＲＮＡｓ是侵染的記憶標記２００７年，乳酸桿菌與嗜熱鏈球首次提供了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ介導適應性免疫實驗證據(jù)［３１］，這個法就是在牛奶工業(yè)生產(chǎn)過程中培養(yǎng)的細菌中含有的天然ＣＲＩ抵御噬菌體的感染，這是一個成功應用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ于生物０８年，有研究報道在大腸桿菌中，具有導向作用的成熟Ｃ）與Ｃａｓ蛋白形成復合物干擾病毒的增殖Ｐｌ，同一年，在病道了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)靶向ＤＮＡ的活性［３４］，后來研究確定重復序列（ＣＲＩＳＰＲ，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ?Ｒｅｇｕｌａｒ丨ｙ?Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ?Ｓｈｏｒｔ和ＣＲＩＳＰＲ相關蛋白是大多數(shù)細菌及古細菌中的一種獲得性來核酸例如來自噬菌體ＤＮＡ或ＲＮＡ，質(zhì)粒和其它外源ＤＮ的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)具有共同的特性，如重復間隔序列，這是Ｃａｓ核酸酶剪切外來核酸的相關特性［３５，３６］。??Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ??

圖３?ＣＲＩＳＰＲ的分類分型［４０，４１］??４?ＣＲＩＳＰＲ的作用機制??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫系統(tǒng)的作用機制主要包括三步，ＤＮＡ的編碼，ＲＮＡ的導向靶向ＤＮＡ。第一步就是間隔序列的獲取，Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２將外源入侵的核酸序列整到ＣＲＩＳＰＲ序列的５’端中也就是鄰近前導序列成為新的間隔序列；第二步是ＣＲＩＳＰ序列表達產(chǎn)生成熟前體ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡ?（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），它是一個單鏈的ＲＮＡ分子含所有的重復間隔序列。Ｉ型系統(tǒng)Ｃａｓ６處理加工Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ?（Ｉ－Ｃ型是由Ｃａｓ５加處理），在ＩＩ型系統(tǒng)中是由ＲＮａｓｅ?ＩＩＩ和Ｃａｓ９加工處理，使ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ成為成熟ｃｒＲＮＡ?（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）；最后一步是干擾與間隔序列互補的入侵核酸。在Ｉ型系中，ｃｒＲＮＡ與Ｃａｓｃａｄｅ復合物相互作用產(chǎn)生效應復合物依賴間隔序列與促間隔序之間的互補性識別和結(jié)合外源入侵的雙鏈ＤＮＡ，并招募Ｃａｓ３來切割靶向ｄｓＤＮｃｒＲＮＡ與互補耙向ＤＮＡ鏈之間的堿基配對將導致非耙向ＤＮＡ鏈Ｒ?ｌｏｏｐ的形成然后Ｃａｓ３的核酸外切酶活性在促間隔序列之內(nèi)切割非靶向鏈并以一種依賴鐵


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