白念珠菌CaPDE2基因的敲除與功能研究
發(fā)布時(shí)間：2020-12-07 14:03
構(gòu)建白念珠菌CaPDE2基因缺失株,研究其功能.通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建含有CaPDE2基因同源臂100 bp的SAT1-flipper敲除盒,用于敲除CaPDE2第一等位基因;然后通過構(gòu)建CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒（同源臂700～1 000 bp）,敲除CaPDE2第二等位基因.將CaPDE2基因缺失株依次培養(yǎng)在YPD+25μg/mL ClonNAT、YPD+0.1%5-FOA培養(yǎng)基中,以去掉SAT1和URA3基因篩選標(biāo)記;通過CaPDE2基因缺失株的表型試驗(yàn)初步檢測(cè)了CaPDE2基因的功能.結(jié)果表明:聯(lián)合采用URA3和SAT1篩選標(biāo)記完成CaPDE2雙等位基因的敲除,得到了CaPDE2基因缺失株,并去掉SAT1和URA3基因標(biāo)記,其基因型為Capde2::FRT/Capde2::hisG. Ca PDE2基因缺失株對(duì)酮康唑、氟康唑、十二烷基硫酸鈉及42℃均敏感.因此,CaPDE2參與調(diào)節(jié)白念珠菌抗真菌藥物、細(xì)胞膜壓力及高溫的耐受性.
【文章來源】：淮北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020年02期 第49-54頁(yè)
【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)
【部分圖文】：
CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2的SacI、HindⅢ雙酶切驗(yàn)證
白念珠菌是二倍體，對(duì)白念珠菌基因的敲除必須敲除目的基因的兩個(gè)等位基因.本研究出發(fā)菌株CAI4是尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株[10]，而且對(duì)諾爾斯菌素敏感[11].白念珠菌CaPDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA通路中的重要成員，該酶催化c AMP水解成5′-AMP而降低胞內(nèi)cAMP濃度，以維持胞內(nèi)適當(dāng)?shù)腸AMP濃度.應(yīng)用諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2第一等位基因.以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4基因組作為模板，PCR擴(kuò)增出大小約為4.3 kb的CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒（圖3）.將該敲除盒轉(zhuǎn)化至CAI4中，涂布于200μg×mL-1ClonNAT的YPD平板，30℃培養(yǎng)48 h，挑取ClonNAT抗性菌株純化，獲得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株，其基因型是Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2.接下來，將構(gòu)建好的含有CaPDE2的URA3-blaster敲除盒的質(zhì)粒pDY2，用SacI和HindⅢ雙酶切，獲得5.7 kb帶有URA3篩選標(biāo)記的CaPDE2敲除盒（圖2）.將此敲除盒轉(zhuǎn)化至菌株Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200μg/mL ClonNAT平板上，30℃培養(yǎng)48～72 h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并驗(yàn)證，獲得敲除CaPDE2第二等位基因菌株.之后用YPD+25μg/mL ClonNAT平板擠掉SAT1抗性基因，進(jìn)一步用YPD+0.1%5-FOA平板去除URA3基因，最終獲得CaPDE2基因缺失株DY-CA1，其基因型為Capde2::FRT/Capde2::hisG（圖4,5）.如圖5所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOW-CHECK：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全長(zhǎng)ORF序列及其一部分啟動(dòng)子和終止子序列）；以CaPDE2基因缺失株的基因組為模板，擴(kuò)增出0.85 kb和1.7 kb（包含hisG序列及CaPDE2基因的一部分啟動(dòng)子和終止子序列）的2個(gè)片段.用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因組為模板，未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明CaPDE2的2個(gè)等位基因都已被敲除.圖4 聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖
聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]分泌型蛋白介導(dǎo)白念珠菌與宿主相互作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 王園園,陳昌斌. 菌物學(xué)報(bào). 2018(10)
[2]白念珠菌生物被膜形成的遺傳調(diào)控機(jī)制[J]. 郭東東,岳慧珍,魏羽佳,黃廣華. 生物工程學(xué)報(bào). 2017(09)
[3]白色念珠菌生物被膜研究進(jìn)展[J]. 李瑞蓮,王倬,杜昱光. 微生物學(xué)報(bào). 2017(08)
本文編號(hào)：2903385
【文章來源】：淮北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020年02期 第49-54頁(yè)
【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)
【部分圖文】：
CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2的SacI、HindⅢ雙酶切驗(yàn)證
白念珠菌是二倍體，對(duì)白念珠菌基因的敲除必須敲除目的基因的兩個(gè)等位基因.本研究出發(fā)菌株CAI4是尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株[10]，而且對(duì)諾爾斯菌素敏感[11].白念珠菌CaPDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA通路中的重要成員，該酶催化c AMP水解成5′-AMP而降低胞內(nèi)cAMP濃度，以維持胞內(nèi)適當(dāng)?shù)腸AMP濃度.應(yīng)用諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2第一等位基因.以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4基因組作為模板，PCR擴(kuò)增出大小約為4.3 kb的CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒（圖3）.將該敲除盒轉(zhuǎn)化至CAI4中，涂布于200μg×mL-1ClonNAT的YPD平板，30℃培養(yǎng)48 h，挑取ClonNAT抗性菌株純化，獲得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株，其基因型是Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2.接下來，將構(gòu)建好的含有CaPDE2的URA3-blaster敲除盒的質(zhì)粒pDY2，用SacI和HindⅢ雙酶切，獲得5.7 kb帶有URA3篩選標(biāo)記的CaPDE2敲除盒（圖2）.將此敲除盒轉(zhuǎn)化至菌株Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200μg/mL ClonNAT平板上，30℃培養(yǎng)48～72 h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并驗(yàn)證，獲得敲除CaPDE2第二等位基因菌株.之后用YPD+25μg/mL ClonNAT平板擠掉SAT1抗性基因，進(jìn)一步用YPD+0.1%5-FOA平板去除URA3基因，最終獲得CaPDE2基因缺失株DY-CA1，其基因型為Capde2::FRT/Capde2::hisG（圖4,5）.如圖5所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOW-CHECK：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全長(zhǎng)ORF序列及其一部分啟動(dòng)子和終止子序列）；以CaPDE2基因缺失株的基因組為模板，擴(kuò)增出0.85 kb和1.7 kb（包含hisG序列及CaPDE2基因的一部分啟動(dòng)子和終止子序列）的2個(gè)片段.用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因組為模板，未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明CaPDE2的2個(gè)等位基因都已被敲除.圖4 聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖
聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]分泌型蛋白介導(dǎo)白念珠菌與宿主相互作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 王園園,陳昌斌. 菌物學(xué)報(bào). 2018(10)
[2]白念珠菌生物被膜形成的遺傳調(diào)控機(jī)制[J]. 郭東東,岳慧珍,魏羽佳,黃廣華. 生物工程學(xué)報(bào). 2017(09)
[3]白色念珠菌生物被膜研究進(jìn)展[J]. 李瑞蓮,王倬,杜昱光. 微生物學(xué)報(bào). 2017(08)
本文編號(hào)：2903385
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