本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：機(jī)體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)量自由基,可直接或間接損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì),使機(jī)體的氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)被打破,利用外源性抗氧化活性物質(zhì)對(duì)抗體內(nèi)過(guò)量自由基是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要手段。傳統(tǒng)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法,因其各自的技術(shù)缺陷,嚴(yán)重制約著抗氧化活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。因此,亟需建立一種新的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。細(xì)胞代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支,因其靈敏度高、選擇性好、快速、準(zhǔn)確性高、可控性強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn),可發(fā)展為一種新的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。與化學(xué)評(píng)價(jià)方法相比較,基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法以細(xì)胞為載體,未脫離生物體本身,更接近于生物體氧化反應(yīng)過(guò)程;與細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)方法相比較,基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法運(yùn)用細(xì)胞代謝組學(xué)研究方法,可全面反映細(xì)胞內(nèi)代謝物信息。本研究采用細(xì)胞代謝組學(xué)研究方法,以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,基于HPLC-DAD-MS技術(shù)平臺(tái),通過(guò)對(duì)細(xì)胞代謝物的分析,結(jié)合多種模式識(shí)別技術(shù),獲取與抗氧化活性相關(guān)的代謝物靶標(biāo),構(gòu)建基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法,并應(yīng)用該方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)細(xì)胞樣品前處理及HPLC分析方法的研究。為最大限度地提取代謝物并取得可靠的分析結(jié)果,對(duì)細(xì)胞樣品前處理及HPLC分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。細(xì)胞代謝物用㧟20°C預(yù)冷的60%甲醇淬滅、超聲波破碎、60%甲醇提取進(jìn)樣分析。HPLC色譜條件為:流速1.0 mL/min;柱溫30°C;色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為1.93 g/L醋酸銨(pH=4.81)和乙腈;溶劑洗脫梯度為0.5-5%乙腈(0-10 min)、5-95%乙腈(10-60 min);檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。(2)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)選擇5mg/L H2O2作用4 h,100 mg/L VE作用24 h,250 mg/L GSH作用24 h建立氧化應(yīng)激模型。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平及酶活性驗(yàn)證氧化應(yīng)激模型。對(duì)細(xì)胞代謝物進(jìn)行HPLC分析,從典型的HPLC-DAD譜圖中選取28個(gè)共有峰進(jìn)行模式識(shí)別分析,借助于OPLS-DA模型的S-plot圖及VIP值篩選出11種潛在的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物。同時(shí),采用LC-MS聯(lián)用技術(shù)得到潛在生物標(biāo)記物的精確相對(duì)分子質(zhì)量,通過(guò)細(xì)胞代謝物與對(duì)照品的紫外光譜圖、保留時(shí)間并結(jié)合加標(biāo)法對(duì)色譜峰定性,其中p1、p2、p3及p9分別鑒定為蘋果酸、VC、GSH及色氨酸。(3)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立。在OPLS-DA模型基礎(chǔ)上,建立了基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定性評(píng)價(jià)方法。以VE或GSH的CMAA unit值為標(biāo)準(zhǔn),定量評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性,建立了基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定量評(píng)價(jià)方法。(4)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用。根據(jù)前期建立的細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物,并運(yùn)用化學(xué)評(píng)價(jià)方法及細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,建立的基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法是可靠的,且結(jié)果與傳統(tǒng)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的結(jié)果一致。多種評(píng)價(jià)方法結(jié)果均顯示,鎖陽(yáng)多糖與鎖陽(yáng)黃酮具有一定的抗氧化活性,且鎖陽(yáng)黃酮抗氧化活性較強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞代謝組學(xué) 抗氧化活性 評(píng)價(jià)方法 生物標(biāo)記物 樣品前處理 模式識(shí)別 鎖陽(yáng)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 抗氧化活性評(píng)價(jià)方法及細(xì)胞代謝組學(xué)研究進(jìn)展11-19
• 1 抗氧化活性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展11-14
• 1.1 體外評(píng)價(jià)方法11-13
• 1.2 體內(nèi)評(píng)價(jià)方法13-14
• 1.3 小結(jié)14
• 2 細(xì)胞代謝組學(xué)研究進(jìn)展14-19
• 2.1 細(xì)胞代謝組學(xué)的發(fā)展歷程14-15
• 2.2 細(xì)胞代謝組學(xué)的研究方法15-16
• 2.3 細(xì)胞代謝組學(xué)的應(yīng)用16-18
• 2.4 小結(jié)18-19
• 第二章 細(xì)胞樣品前處理及HPLC分析方法的研究19-30
• 1 儀器，材料與試劑19-20
• 1.1 儀器19-20
• 1.2 試劑20
• 1.3 材料20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-22
• 2.1 細(xì)胞樣品前處理方法的研究20-21
• 2.2 HPLC分析方法的研究21-22
• 3 結(jié)果與分析22-29
• 3.1 細(xì)胞樣品前處理方法的研究22-25
• 3.2 HPLC分析方法的研究25-28
• 3.3 方法學(xué)驗(yàn)證28-29
• 4 結(jié)論29-30
• 第三章 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)30-43
• 1 儀器，材料與試劑30-31
• 1.1 儀器30-31
• 1.2 試劑31
• 1.3 材料31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 2.1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建31-32
• 2.2 細(xì)胞樣品前處理32
• 2.3 色譜分析32-33
• 3 數(shù)據(jù)處理33
• 4 結(jié)果與分析33-42
• 4.1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建33-35
• 4.2 細(xì)胞代謝物HPLC譜圖35-36
• 4.3 潛在氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)36-42
• 5 結(jié)論42-43
• 第四章 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立43-50
• 1 儀器，材料與試劑43
• 1.1 儀器43
• 1.2 試劑43
• 1.3 材料43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 2.1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建43-44
• 2.2 樣品前處理44
• 2.3 色譜分析44
• 3 數(shù)據(jù)處理44
• 4 結(jié)果與分析44-49
• 4.1 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定性評(píng)價(jià)方法的建立44-47
• 4.2 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定量評(píng)價(jià)方法的建立47-49
• 5 結(jié)論49-50
• 第五章 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用50-59
• 1 儀器，材料與試劑50-51
• 1.1 儀器50
• 1.2 試劑50-51
• 1.3 材料51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-52
• 2.1 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物51
• 2.2 傳統(tǒng)的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物51-52
• 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析52
• 4 結(jié)果與分析52-58
• 4.1 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物52-55
• 4.2 傳統(tǒng)的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物55-58
• 5 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 研究生階段的研究成果64-65
• 致謝65

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6 李雪林 楊磊;“代謝組學(xué)”助中醫(yī)藥走向世界[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

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