背景手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)是由腸道病毒感染引起的常見小兒傳染病。由于目前尚無有效的治療方法,該病每年的發(fā)病率仍居我國丙類傳染病之首,已成為嚴重影響嬰幼兒健康的重要公共衛(wèi)生問題。近年來,隨著HFMD病原譜的演變,除常見的腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A 16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)外,柯薩奇病毒A 2型(Coxsackievirus A 2,CVA2)、柯薩奇病毒A 10型(Coxsackievirus A 10,CVA10)及柯薩奇病毒A 6型(Coxsackievirus A 6,CVA6)等新型腸道病毒感染病例逐漸增多。目前關(guān)于HFMD的研究多集中在EV71和CVA16,而CVA2方面的研究甚少報道。目的1.研究新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院感染科HFMD的病原譜特征。2.鑒定臨床來源的CVA2病毒株,并研究其體外毒力和對天然免疫信號的影響。3.構(gòu)建CVA2感染乳鼠模型。方法1.采集2017年5月~8月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院住院治療的HFMD患兒糞便標本19例,用橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)分離病毒并擴增,提取病毒RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,使用腸道病毒VP1通用引物、EV71病毒和CVA16病毒VP1保守序列引物對cDNA進行擴增,產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,并對測序結(jié)果進行比對。設(shè)計CVA2 VP1全長引物,對測序結(jié)果為CVA2的病毒cDNA(樣品11-1)進行PCR擴增,同樣克隆后測序,對獲得的CVA2 VP1全長序列進行系統(tǒng)進化樹分析。2.將樣品11-1分離得到的CVA2病毒以MOI=0.1接種RD細胞,分別在感染后0、4、8、16、24、48 h檢測CVA2 mRNA的表達量。將該CVA2病毒以MOI=0、0.1、0.25、0.5、1和2感染RD細胞,24 h后提取總RNA和蛋白,用熒光定量PCR方法檢測細胞因子IFN-β1、IL-1β、IL-6以及凋亡相關(guān)基因Caspase-8、Caspase-9和Cyto C mRNA的表達水平,采用Western blot檢測天然免疫信號相關(guān)蛋白RIG-I、MAVS、IRAK1、TRAF6、pTBK1和TBK1以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達水平。3.將CVA2以顱內(nèi)注射的方式(1×10~6 pfu/小鼠)感染10只5日齡BALB/c乳鼠,記錄乳鼠生存情況。對照組(Mock)組5日齡BALB/c乳鼠乳鼠顱內(nèi)注射等體積RD細胞培養(yǎng)上清液。感染后第7天,分別取小鼠腦、肺、心臟、脾、骨骼肌、小腸、脾、肝和腎組織,4%多聚甲醛固定48小時后,采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色觀察病理學改變。結(jié)果1.19例HFMD病例的病原體測序結(jié)果顯示,其他腸道病毒、EV71、CVA16和CVA2的百分比分別為36.84%、10.53%、36.84%和15.79%。將19例樣品的RT-PCR與測序結(jié)果比較顯示7、11和12號樣品PCR電泳結(jié)果與測序結(jié)果不一致,經(jīng)進一步測序比對后發(fā)現(xiàn),7、11和12號樣品為CVA2型。2.RD細胞中CVA2 mRNA水平在CVA2感染后24 h和48 h均顯著升高(P0.05)。同時,RD細胞中和炎癥細胞因子IL-1β和IL-6 mRNA在CVA2感染后表達水平均顯著升高(P0.05),而抗病毒基因IFN-β1 mRNA的表達水平顯著降低(P0.05)。凋亡相關(guān)基因的檢測結(jié)果顯示,CVA2感染后,RD細胞中Caspase-8、Caspase-9的表達水平顯著升高(P0.05),Cyto C mRNA的表達水平先上升后下降,凋亡蛋白Caspase-3表達水平降低,而Cleaved Caspase-3表達水平升高。天然免疫信號檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CVA2感染后,RD細胞中RIG-I、MAVS和pTBK1表達量升高,而IRAK1和TRAF6表達量降低。3.乳鼠感染CVA2后出現(xiàn)明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。HE染色顯示腦組織出現(xiàn)神經(jīng)元退行性改變和炎癥細胞浸潤,肺組織出現(xiàn)充血、腫脹,表現(xiàn)為肺泡腔增大,肺間質(zhì)增厚,并伴有大量紅細胞和炎癥細胞浸潤。心肌組織表現(xiàn)心肌炎改變,表現(xiàn)為右心房擴張,房室壁增厚以及炎性細胞浸潤。骨骼肌出現(xiàn)明顯溶解和壞死,并伴炎癥細胞浸潤。小腸絨毛斷裂,呈現(xiàn)不規(guī)則排列。腎臟和肝臟出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。結(jié)論1.本論文研究所檢測的19例HFMD患者的病原譜中,鑒定出了CVA2。2.本研究分離的CVA2毒株在體外可誘導細胞凋亡,并能夠影響天然免疫信號轉(zhuǎn)導。3.CVA2可通過顱內(nèi)注射成功感染5日齡BALB/c乳鼠,引起乳鼠神經(jīng)系統(tǒng)、肺部、骨骼肌和心肌病變。
【學位單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R725.1;R-332
【部分圖文】：

2 結(jié)果2.1 樣品采集與鑒定結(jié)果2.1.1 樣本病毒擴增正常 RD 細胞呈貼壁生長，RD 細胞感染腸道病毒后可出現(xiàn) CPE 改變，表現(xiàn)為細胞變圓、脫落、折光性增加，并相互聚集。19 例確診手足口病標本經(jīng) RD 細胞擴增 4代后，4、8、11、12、13 號樣品可見明顯 CPE 表現(xiàn)，7、9、10、15、17、18、19 號樣品可見 CPE 表現(xiàn)，1、2、6、14 號樣品 CPE 表現(xiàn)不明顯，3、5、16 號樣品未見明顯 CPE 表現(xiàn)（圖 1）。

樣品病毒鑒定 RT-PCR 鑒定別用 PE、EV71 和 CVA16 三對核酸檢測引物對 19 例樣品分別進行 PC結(jié)果顯示：4、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 和示 PE 核酸陽性；7、8、11、12、13 和 14 號樣本顯示 EV71 核酸陽性；15、16、17 和 18 號樣本為 CVA16 核酸陽性，分別見圖 2、3 和 4。

結(jié)果顯示：4、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 和顯示 PE 核酸陽性；7、8、11、12、13 和 14 號樣本顯示 EV71 核酸陽性；4、15、16、17 和 18 號樣本為 CVA16 核酸陽性，分別見圖 2、3 和 4。圖 2：PE 引物 RT-PCR 擴增結(jié)果500 bp DNAMarker；1～19：手足口�。�20：EV71 陽性對照；21：陰性
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本文編號：2892801