隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,男性參與家庭計(jì)劃的意愿也日趨強(qiáng)烈,但可供選擇的避孕措施十分局限。免疫避孕疫苗具有多重優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為在男性避孕中將是最具前景的措施之一。促卵泡生成素/促卵泡生成素受體(Follicle stimulating hormone/Follicle stimulating hormone receptor;FSH/FSHR)信號(hào)參與調(diào)節(jié)啟動(dòng)精子發(fā)生和維持精子正常生成,是男性生殖中的重要環(huán)節(jié);而且在男性FSHR僅表達(dá)于睪丸支持細(xì)胞,因此FSHR被選擇成為避孕研究的靶標(biāo)之一。近期,基于FSHR避孕疫苗的研究獲得了令人欣喜的成果,利用計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)技術(shù)篩選出的FSHR32-44肽段,經(jīng)體內(nèi)驗(yàn)證成功避免了以往FSHR疫苗對(duì)生殖器官損傷的副作用,并能誘導(dǎo)生育抑制的作用。但仍有一些局限性,尚不能應(yīng)用于臨床,如FSHR表位疫苗免疫原性差,誘導(dǎo)的抗體滴度低;聯(lián)合使用的氟氏佐劑存在安全性問題;融合多肽載體引起免疫偏移誘導(dǎo)免疫損傷風(fēng)險(xiǎn)�；诩{米載體的遞送系統(tǒng)具有安全、高效、靶向和副作用小的特點(diǎn),在藥物遞送和腫瘤疫苗中已顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此,為解決表位疫苗存在的上述問題,本研究擬設(shè)計(jì)并構(gòu)建FSHR優(yōu)勢(shì)表位納米疫苗。本研究以前期實(shí)驗(yàn)中篩選的FSHR無病理損害優(yōu)勢(shì)表位為基礎(chǔ),使用p H敏感材料縮醛化β-環(huán)糊精(Acetalatedβetalated trin,Ac-bCD)和非敏感性材料聚(乳酸-羥基乙酸)(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)為載體,設(shè)計(jì)構(gòu)建具有不同p H特性的表位肽納米避孕疫苗(FSHR/Ac-b CD NP和FSHR/PLGA NP),分別通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究納米疫苗的免疫效應(yīng)和抗生育作用。課題研究分為以下三個(gè)部分。一、不同pH響應(yīng)性的FSHR納米疫苗的制備及其表征以本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作中篩選的FSHR優(yōu)勢(shì)抗原表位(IELRFVLTKLRVI)為靶抗原,采用固相合成技術(shù),人工合成高純度的FSHR32-44肽段,分別使用Ac-b CD和PLGA材料作為載體,通過乳化法制備了FSHR納米疫苗。結(jié)果顯示,采用固相合成法獲得的FSHR肽純度大于95%,兩種材料均能成功包載多肽,形成粒徑200 nm左右的納米粒,包封率60%以上。透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)和掃描電鏡(Scanning electron microscopy,SEM)觀察表明納米粒形態(tài)規(guī)整、粒徑分布均勻,體外水解和釋放實(shí)驗(yàn)均證實(shí)fshr/ac-bcdnp有在ph5.0的溶液中快速水解的特點(diǎn),可釋放出fshr多肽,而在ph7.4的溶液中和plganp一樣呈緩釋特征。二、fshr表位納米疫苗的體外免疫效應(yīng)使用骨髓來源誘導(dǎo)培養(yǎng)的未成熟樹突狀細(xì)胞(immaturedendriticcells,idcs)進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。用不同劑型的fshr多肽抗原刺激idcs,利用激光共聚焦和流式細(xì)胞技術(shù)觀察樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,dcs)對(duì)抗原的吞噬能力和特點(diǎn);并觀察不同抗原刺激后dcs的表型分子變化,以及誘導(dǎo)t淋巴細(xì)胞增殖和分泌因子的能力。結(jié)果表明,通過細(xì)胞因子誘導(dǎo),可以獲得80%以上cd11c+的功能健全的idc;納米化抗原利于idc吞噬,提高了抗原的攝取量,具有時(shí)間和劑量依賴特征;fshr/plganp能有效刺激dcs,提高表面分子cd40、cd80、cd86和mhc-ii的表達(dá)量;攝取了納米抗原的dcs能有效刺激t淋巴細(xì)胞增殖,并大量分泌炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)和γ-干擾素(interferon-γ,ifn-γ),其中ac-bcd和plga材料組無明顯差異。三、不同ph響應(yīng)性的fshr納米疫苗的體內(nèi)效應(yīng)研究選擇c57bl/6j雄性成年小鼠作為免疫對(duì)象,具體分組包括pbs(phosphatebuffersolution,磷酸鹽緩沖液)、fshr、fshr/cfa、fshr/ac-bcdnp和fshr/plganp組;采用足墊皮內(nèi)和皮下多點(diǎn)、多次免疫的方法。通過眼眶采血,elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))法檢測(cè)免疫前、后血清抗體滴度和睪酮水平變化;合籠觀察雌鼠受孕率及產(chǎn)仔率評(píng)價(jià)對(duì)應(yīng)組別雄鼠生育抑制程度,檢測(cè)分析附睪精子質(zhì)量;檢查抗體水平下降后小鼠重要臟器和生殖器官的病理學(xué)變化,并利用硝酸鑭示蹤結(jié)合tem觀察血睪屏障完整性。該部分研究結(jié)果顯示fshr/cfa、fshr/ac-bcdnp和fshr/plganp組均可以誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生,納米組抗體水平高于氟氏佐劑組,于初免后9周達(dá)高峰,其中plga組抗體水平最高達(dá)1:3200。生育抑制實(shí)驗(yàn)和精子質(zhì)量分析均同抗體水平結(jié)果相似,有抗體產(chǎn)生的3組均有明顯生育抑制作用,以plga組生育力最低為25%;抗體滴度越高總精子數(shù)越少、精子活力越下降,畸形精子百分比越上升。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫前后各組間小鼠血清睪酮水平無變化,重要臟器肝、脾、腎和生殖器官睪丸、附睪的蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,he染色)也未見明顯病理學(xué)變化。tem觀察硝酸鑭僅沉積于支持細(xì)胞緊密連接之外,未向曲細(xì)精管內(nèi)部滲透,提示血睪屏障完整功能健全。由此可以得出結(jié)論,本研究構(gòu)建的納米材料可以作為避孕疫苗的載體,具有良好的生物相容性和佐劑作用,且無明顯的毒副作用,將納米疫苗靶向樹突狀細(xì)胞是提高免疫效果的有效途徑。不過,p H敏感性Ac-b CD材料在提高免疫應(yīng)答能力上,并未顯示出優(yōu)于非p H敏感性PLGA材料的作用。這為我們將來優(yōu)化納米疫苗的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)研究支持。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
英文縮寫詞表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
    1.1 選題緣由
    1.2 研究背景
    1.3 研究意義
    1.4 研究?jī)?nèi)容
    1.5 研究方法
第二章 不同pH響應(yīng)性的FSHR納米避孕疫苗的設(shè)計(jì)、制備及其表征
    2.1 材料與方法
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
第三章 不同pH響應(yīng)性的FSHR納米避孕疫苗的體外免疫效應(yīng)的研究
    3.1 材料與方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
第四章 不同pH響應(yīng)性的FSHR納米避孕疫苗的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)
    4.1 材料與方法
    4.2 結(jié)果
    4.3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 免疫避孕疫苗的最新研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
碩士期間發(fā)表論文的情況
致謝

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