背景:自噬(autophagy)是一種由營(yíng)養(yǎng)饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激、自由基氧化應(yīng)激等信號(hào)引起的溶酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程,其在細(xì)胞能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞生存等過(guò)程中起至關(guān)重要的調(diào)控作用。自噬過(guò)程異常與多種疾病直接相關(guān),研究自噬過(guò)程的分子機(jī)理及其調(diào)節(jié)信號(hào)通路,可能促進(jìn)發(fā)現(xiàn)疾病治療的新方法和新靶點(diǎn)。早期的研究認(rèn)為自噬對(duì)底物沒(méi)有選擇性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)很多自噬過(guò)程,如損壞的線粒體、過(guò)氧化物體等細(xì)胞器以及變性蛋白聚集物的自噬清除,自噬底物首先經(jīng)過(guò)泛素化標(biāo)記,然后由自噬受體(autophagy receptor)識(shí)別結(jié)合泛素化的底物并通過(guò)自噬體蛋白LC3將自噬底物連接到自噬前體(phagophore),形成自噬體(autophagosomes)后運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解。這一類由自噬受體選擇識(shí)別泛素化自噬底物的自噬過(guò)程稱為選擇性自噬(selective autophagy)。目前,針對(duì)泛素化對(duì)自噬過(guò)程調(diào)節(jié)的研究主要集中在選擇性自噬底物的調(diào)控上,而對(duì)自噬蛋白本身以及選擇性自噬的啟動(dòng)、活化和自噬體形成的調(diào)控等方面的研究則相對(duì)較少。因此,深入研究泛素化對(duì)自噬蛋白及自噬受體的調(diào)控作用,對(duì)于理解選擇性自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制具有較大的理論意義。NEDD4(又稱NEDD4-1)是屬于HECT家族的泛素連接酶,最初是在小鼠神經(jīng)元前體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的,其在多種腫瘤組織高度表達(dá)。在篩選NEDD4的泛素化底物時(shí)發(fā)現(xiàn)NEDD4傾向于泛素化酪氨酸激酶及內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)分類蛋白,其通過(guò)泛素化不同的底物參與調(diào)控離子通道的活性、膜受體的內(nèi)吞、病毒出芽以及神經(jīng)元發(fā)育等生理過(guò)程。目前已有個(gè)別研究表明,NEDD4可能在自噬過(guò)程中起著重要作用,但其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)過(guò)程及機(jī)制并不清楚。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn),NEDD4含有4個(gè)潛在的WXXL/I,提示NEDD4很可能與LC3相互作用并參與自噬特別是選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)。因而進(jìn)一步研究泛素連接酶NEDD4在自噬泛素化調(diào)節(jié)中的作用,對(duì)于理解選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)機(jī)理,具有重要的理論意義。研究目的:本文旨在研究泛素連接酶NEDD4與自噬體蛋白LC3及自噬受體SQSTM1之間的關(guān)系,深入探討NEDD4介導(dǎo)的自噬受體SQSTM1泛素化信號(hào)在選擇性自噬過(guò)程中的作用及其機(jī)制,為選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)提供新的理論依據(jù),為自噬相關(guān)疾病的臨床治療提供新的方向和思路。研究方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和處理HEK293T,HEK293A,A549,HepG2和BE(2)-C cells均購(gòu)于ATCC。細(xì)胞以含有1%penicillin/streptomycin和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO_2條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求,細(xì)胞給予饑餓或1uM Rapamycin處理18h以激活自噬,或者溶酶體抑制劑Chloroquine(50uM)處理18h。在SQSTM1和NBR1泛素化分析相關(guān)試驗(yàn)中,細(xì)胞使用10uM MG132或10uM Bortezomib預(yù)處理18h以抑制蛋白降解。2.蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blot)通過(guò)Western blot技術(shù)對(duì)相應(yīng)蛋白指標(biāo)NEDD4,LC3,SQSTM1,BECN1,PDCD6IP及NBR1在細(xì)胞中進(jìn)行半定量。3.免疫共沉淀(CO-IP)和GST-LC3B pulldown實(shí)驗(yàn)使用CO-IP和GST-LC3B pulldown技術(shù)獲得與NEDD4蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì),通過(guò)Western blot檢測(cè)NEDD4與相應(yīng)蛋白結(jié)合情況。4.慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)PCR以及分子克隆技術(shù)構(gòu)建pLKO.1-shNEDD4和pFUW-HA-NEDD4-q(the shRNA-resistant NEDD4)慢病毒載體用以分別沉默、恢復(fù)表達(dá)NEDD4。過(guò)表達(dá)pLVTHM-GFP-LC3和pLVTHM-GFP-SQSTM1用來(lái)示蹤自噬。5.透射電子顯微鏡技術(shù)(TEM)采用TEM觀察對(duì)照組和NEDD4 shRNA組細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體形成的變化,評(píng)價(jià)敲低NEDD4對(duì)自噬的影響。6.細(xì)胞免疫熒光利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察細(xì)胞自噬過(guò)程、亞細(xì)胞蛋白定位以及膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。7.Cyto-ID自噬檢測(cè)試劑盒染色選用Cyto-ID自噬檢測(cè)試劑盒使活細(xì)胞中的自噬體攜帶標(biāo)記,在共聚焦顯微鏡下跟蹤活細(xì)胞中標(biāo)記的自噬體,動(dòng)態(tài)觀察自噬過(guò)程,并定量分析自噬過(guò)程。8.泛素化蛋白檢測(cè)采用CO-IP結(jié)合Western blot技術(shù)和GST-Uba pulldown結(jié)合Western blot技術(shù)檢測(cè)泛素化蛋白。首先用一抗IP再進(jìn)行SDS-PAGE電泳孵育anti-Ub抗體檢測(cè)泛素化蛋白,或者先采用GST-Uba親和沉淀再進(jìn)行SDS-PAGE電泳孵育anti-SQSTM1抗體檢測(cè)泛素化蛋白。9.離體E3泛素連接酶活性測(cè)定在HEK293T細(xì)胞里過(guò)表達(dá)NEDD4,通過(guò)免疫沉淀分離NEDD4,將免疫沉淀的NEDD4與不同量的純化LC3B蛋白在冰上共同孵育;然后添加單體泛素到反應(yīng)混合物中啟動(dòng)泛素連接反應(yīng);最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離多聚泛素,通過(guò)anti-Ub抗體檢測(cè)由單泛素綴合的多聚泛素產(chǎn)物,以評(píng)估NEDD4的連接酶活性。研究結(jié)果:1.免疫共沉淀和GST-LC3B pulldown結(jié)果表明NEDD4能與自噬體蛋白LC3相互作用,并鑒定出NEDD4中的LIR2結(jié)構(gòu)域是與LC3結(jié)合的位點(diǎn)。2.NEDD4敲低導(dǎo)致嚴(yán)重的自噬缺陷,引起SQSTM1蛋白累積,并阻斷Rapamycin或饑餓誘導(dǎo)的自噬激活。3.NEDD4敲低誘導(dǎo)LC3陽(yáng)性自噬前體和自噬體變形和聚集,并且NEDD4敲低誘導(dǎo)聚集的GFP-LC3B斑點(diǎn)與ER膜標(biāo)志物共定位。4.電子顯微鏡觀察到敲低NEDD4導(dǎo)致肺癌A549細(xì)胞中的線粒體變形,提示NEDD4可能在線粒體自噬中發(fā)揮一定作用。5.LC3不是NEDD4的泛素化底物,而是NEDD4的活化蛋白。6.NEDD4通過(guò)其HECT結(jié)構(gòu)域直接與自噬受體SQSTM1的PB1結(jié)構(gòu)域相互作用并使其發(fā)生泛素化,NEDD4對(duì)SQSTM1的泛素化是在PB1結(jié)構(gòu)域上通過(guò)K63位交聯(lián)形成的,此泛素化并不涉及到蛋白酶體介導(dǎo)的降解;而另一自噬受體NBR1既不是NEDD4的結(jié)合蛋白也不是NEDD4的泛素化底物。7.敲低NEDD4或過(guò)表達(dá)NEDD4連接酶失活突變體(NEDD4-LD)引起包涵體自噬缺陷,導(dǎo)致異常增大的SQSTM1陽(yáng)性包涵體聚集,并且與ER標(biāo)記物CANX共定位。研究結(jié)論:自噬體蛋白LC3與NEDD4結(jié)合并激活NEDD4的連接酶活性,可能促進(jìn)NEDD4與自噬受體SQSTM1特異結(jié)合并泛素化SQSTM1,并且該泛素化信號(hào)調(diào)控SQSTM1介導(dǎo)的包涵體自噬。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

細(xì)胞自噬類型[21]

圖 1.2 自噬受體蛋白結(jié)構(gòu)[100]Figure 1.2 Domain structures of autophagy receptor proteins.1.5.1 SQSTM1 蛋白p62/SQSTM1（以下簡(jiǎn)稱 SQSTM1），是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的自噬受體蛋01]。SQSTM1 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白[102]，最初被鑒定為 p56lck SH 結(jié)構(gòu)域的磷酸酸非依賴性配體[103]。Shin 首先克隆出 p62，并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn) p62 具有蛋白聚集體的能力，據(jù)此 Shin 將 p62 命名為 sequestosome 1 (SQSTM1) [104]后，其在小鼠、大鼠以及果蠅中的同源物分別命名為A170、ZIP和Ref(2)P[105-1鼠 A170，與人 SQSTM1 同源，最初在巨噬細(xì)胞中被認(rèn)為是應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞白[108]。目前，SQSTM1 被認(rèn)為是一種多功能蛋白[102]，人類 SQSTM1 由 4氨基酸組成，具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：氨基末端 PB1 結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)自身

圖 1.3 自噬相關(guān)的人類疾病[130]Figure 1.3 Autophagy-related human diseases1.2 泛素化及泛素連接酶 NEDD41.2.1 泛素化反應(yīng)翻譯后修飾（post-translational modification, PTM）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能多樣化的基本機(jī)制，控制基因組中幾乎所有蛋白編碼基因的活性。在各種 PTM 類型中，泛素化，可共價(jià)結(jié)合 76 個(gè)氨基酸組成的小分子多肽泛素（ubiquitin, Ub），在蛋白酶體和溶酶體介導(dǎo)的蛋白降解、膜受體內(nèi)吞、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞自噬中至關(guān)重要。泛素化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條主要途徑，通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng) UPS控制蛋白質(zhì)降解。泛素化是一種高度有序的三級(jí)聯(lián)酶促過(guò)程：活化、交聯(lián)和連接。
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