背景:自噬(autophagy)是一種由營養(yǎng)饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應激、自由基氧化應激等信號引起的溶酶體介導的降解過程,其在細胞能量代謝、應激反應、細胞生存等過程中起至關重要的調(diào)控作用。自噬過程異常與多種疾病直接相關,研究自噬過程的分子機理及其調(diào)節(jié)信號通路,可能促進發(fā)現(xiàn)疾病治療的新方法和新靶點。早期的研究認為自噬對底物沒有選擇性。近年來研究發(fā)現(xiàn)很多自噬過程,如損壞的線粒體、過氧化物體等細胞器以及變性蛋白聚集物的自噬清除,自噬底物首先經(jīng)過泛素化標記,然后由自噬受體(autophagy receptor)識別結合泛素化的底物并通過自噬體蛋白LC3將自噬底物連接到自噬前體(phagophore),形成自噬體(autophagosomes)后運送到溶酶體進行降解。這一類由自噬受體選擇識別泛素化自噬底物的自噬過程稱為選擇性自噬(selective autophagy)。目前,針對泛素化對自噬過程調(diào)節(jié)的研究主要集中在選擇性自噬底物的調(diào)控上,而對自噬蛋白本身以及選擇性自噬的啟動、活化和自噬體形成的調(diào)控等方面的研究則相對較少。因此,深入研究泛素化對自噬蛋白及自噬受體的調(diào)控作用,對于理解選擇性自噬的調(diào)節(jié)機制具有較大的理論意義。NEDD4(又稱NEDD4-1)是屬于HECT家族的泛素連接酶,最初是在小鼠神經(jīng)元前體細胞中被發(fā)現(xiàn)的,其在多種腫瘤組織高度表達。在篩選NEDD4的泛素化底物時發(fā)現(xiàn)NEDD4傾向于泛素化酪氨酸激酶及內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運分類蛋白,其通過泛素化不同的底物參與調(diào)控離子通道的活性、膜受體的內(nèi)吞、病毒出芽以及神經(jīng)元發(fā)育等生理過程。目前已有個別研究表明,NEDD4可能在自噬過程中起著重要作用,但其對自噬的調(diào)節(jié)過程及機制并不清楚。通過序列分析發(fā)現(xiàn),NEDD4含有4個潛在的WXXL/I,提示NEDD4很可能與LC3相互作用并參與自噬特別是選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)。因而進一步研究泛素連接酶NEDD4在自噬泛素化調(diào)節(jié)中的作用,對于理解選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)機理,具有重要的理論意義。研究目的:本文旨在研究泛素連接酶NEDD4與自噬體蛋白LC3及自噬受體SQSTM1之間的關系,深入探討NEDD4介導的自噬受體SQSTM1泛素化信號在選擇性自噬過程中的作用及其機制,為選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)提供新的理論依據(jù),為自噬相關疾病的臨床治療提供新的方向和思路。研究方法:1.細胞培養(yǎng)和處理HEK293T,HEK293A,A549,HepG2和BE(2)-C cells均購于ATCC。細胞以含有1%penicillin/streptomycin和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO_2條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同實驗要求,細胞給予饑餓或1uM Rapamycin處理18h以激活自噬,或者溶酶體抑制劑Chloroquine(50uM)處理18h。在SQSTM1和NBR1泛素化分析相關試驗中,細胞使用10uM MG132或10uM Bortezomib預處理18h以抑制蛋白降解。2.蛋白質(zhì)免疫印跡技術(Western blot)通過Western blot技術對相應蛋白指標NEDD4,LC3,SQSTM1,BECN1,PDCD6IP及NBR1在細胞中進行半定量。3.免疫共沉淀(CO-IP)和GST-LC3B pulldown實驗使用CO-IP和GST-LC3B pulldown技術獲得與NEDD4蛋白相結合的蛋白質(zhì),通過Western blot檢測NEDD4與相應蛋白結合情況。4.慢病毒載體表達系統(tǒng)通過PCR以及分子克隆技術構建pLKO.1-shNEDD4和pFUW-HA-NEDD4-q(the shRNA-resistant NEDD4)慢病毒載體用以分別沉默、恢復表達NEDD4。過表達pLVTHM-GFP-LC3和pLVTHM-GFP-SQSTM1用來示蹤自噬。5.透射電子顯微鏡技術(TEM)采用TEM觀察對照組和NEDD4 shRNA組細胞中自噬體和自噬溶酶體形成的變化,評價敲低NEDD4對自噬的影響。6.細胞免疫熒光利用免疫熒光標記技術觀察細胞自噬過程、亞細胞蛋白定位以及膜泡轉(zhuǎn)運過程。7.Cyto-ID自噬檢測試劑盒染色選用Cyto-ID自噬檢測試劑盒使活細胞中的自噬體攜帶標記,在共聚焦顯微鏡下跟蹤活細胞中標記的自噬體,動態(tài)觀察自噬過程,并定量分析自噬過程。8.泛素化蛋白檢測采用CO-IP結合Western blot技術和GST-Uba pulldown結合Western blot技術檢測泛素化蛋白。首先用一抗IP再進行SDS-PAGE電泳孵育anti-Ub抗體檢測泛素化蛋白,或者先采用GST-Uba親和沉淀再進行SDS-PAGE電泳孵育anti-SQSTM1抗體檢測泛素化蛋白。9.離體E3泛素連接酶活性測定在HEK293T細胞里過表達NEDD4,通過免疫沉淀分離NEDD4,將免疫沉淀的NEDD4與不同量的純化LC3B蛋白在冰上共同孵育;然后添加單體泛素到反應混合物中啟動泛素連接反應;最后進行SDS-PAGE電泳分離多聚泛素,通過anti-Ub抗體檢測由單泛素綴合的多聚泛素產(chǎn)物,以評估NEDD4的連接酶活性。研究結果:1.免疫共沉淀和GST-LC3B pulldown結果表明NEDD4能與自噬體蛋白LC3相互作用,并鑒定出NEDD4中的LIR2結構域是與LC3結合的位點。2.NEDD4敲低導致嚴重的自噬缺陷,引起SQSTM1蛋白累積,并阻斷Rapamycin或饑餓誘導的自噬激活。3.NEDD4敲低誘導LC3陽性自噬前體和自噬體變形和聚集,并且NEDD4敲低誘導聚集的GFP-LC3B斑點與ER膜標志物共定位。4.電子顯微鏡觀察到敲低NEDD4導致肺癌A549細胞中的線粒體變形,提示NEDD4可能在線粒體自噬中發(fā)揮一定作用。5.LC3不是NEDD4的泛素化底物,而是NEDD4的活化蛋白。6.NEDD4通過其HECT結構域直接與自噬受體SQSTM1的PB1結構域相互作用并使其發(fā)生泛素化,NEDD4對SQSTM1的泛素化是在PB1結構域上通過K63位交聯(lián)形成的,此泛素化并不涉及到蛋白酶體介導的降解;而另一自噬受體NBR1既不是NEDD4的結合蛋白也不是NEDD4的泛素化底物。7.敲低NEDD4或過表達NEDD4連接酶失活突變體(NEDD4-LD)引起包涵體自噬缺陷,導致異常增大的SQSTM1陽性包涵體聚集,并且與ER標記物CANX共定位。研究結論:自噬體蛋白LC3與NEDD4結合并激活NEDD4的連接酶活性,可能促進NEDD4與自噬受體SQSTM1特異結合并泛素化SQSTM1,并且該泛素化信號調(diào)控SQSTM1介導的包涵體自噬。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

細胞自噬類型[21]

圖 1.2 自噬受體蛋白結構[100]Figure 1.2 Domain structures of autophagy receptor proteins.1.5.1 SQSTM1 蛋白p62/SQSTM1（以下簡稱 SQSTM1），是第一個被鑒定出來的自噬受體蛋01]。SQSTM1 是一種細胞內(nèi)蛋白[102]，最初被鑒定為 p56lck SH 結構域的磷酸酸非依賴性配體[103]。Shin 首先克隆出 p62，并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn) p62 具有蛋白聚集體的能力，據(jù)此 Shin 將 p62 命名為 sequestosome 1 (SQSTM1) [104]后，其在小鼠、大鼠以及果蠅中的同源物分別命名為A170、ZIP和Ref(2)P[105-1鼠 A170，與人 SQSTM1 同源，最初在巨噬細胞中被認為是應激誘導的細胞白[108]。目前，SQSTM1 被認為是一種多功能蛋白[102]，人類 SQSTM1 由 4氨基酸組成，具有多個功能結構域：氨基末端 PB1 結構域，主要負責自身

圖 1.3 自噬相關的人類疾病[130]Figure 1.3 Autophagy-related human diseases1.2 泛素化及泛素連接酶 NEDD41.2.1 泛素化反應翻譯后修飾（post-translational modification, PTM）是蛋白質(zhì)結構和功能多樣化的基本機制，控制基因組中幾乎所有蛋白編碼基因的活性。在各種 PTM 類型中，泛素化，可共價結合 76 個氨基酸組成的小分子多肽泛素（ubiquitin, Ub），在蛋白酶體和溶酶體介導的蛋白降解、膜受體內(nèi)吞、基因轉(zhuǎn)錄以及細胞自噬中至關重要。泛素化是細胞信號轉(zhuǎn)導的一條主要途徑，通過泛素蛋白酶體系統(tǒng) UPS控制蛋白質(zhì)降解。泛素化是一種高度有序的三級聯(lián)酶促過程：活化、交聯(lián)和連接。
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