目的隨著蛋白質(zhì)組學(xué)與多肽組學(xué)的發(fā)展,快速獲取小分子多肽的濃度對(duì)研究多肽的性能及作用機(jī)制十分重要。目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)定小分子多肽濃度的方法在難易度、適用范圍、經(jīng)濟(jì)性等方面各有千秋,因此,有待我們提出一種快速簡(jiǎn)便的多肽濃度測(cè)定方法。方法將牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)與固相合成環(huán)肽CYE(NH_2-CYENLRSTC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))、CLP(NH_2-CLPLWYPSC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))及CHY(NH_2-CHYPTYSKC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))溶液梯度稀釋后分別使用消光系數(shù)法和BCA法進(jìn)行吸光度測(cè)定,通過消光系數(shù)公式或標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算相應(yīng)濃度值,比較濃度計(jì)算值與理論值之間的差異并計(jì)算測(cè)定方法的精密度。將對(duì)羥磷灰石粉末可能有不同親和力的多肽CYE與1018(VRLIVAVRIWRR)溶液進(jìn)行梯度稀釋,以非特異性吸附的BSA為對(duì)照,分別與25mg/mL羥磷灰石懸浮液在37℃下共同孵育1小時(shí),離心后取上清液并應(yīng)用個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法進(jìn)行濃度測(cè)定,根據(jù)濃度計(jì)算結(jié)果評(píng)價(jià)BSA、CYE與1018在羥磷灰石粉末表面的吸附量。結(jié)果消光系數(shù)法的濃度計(jì)算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。BCA法中,以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品得到的多肽濃度計(jì)算值與理論值之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);以待測(cè)多肽自身為標(biāo)準(zhǔn)品求得的多肽濃度計(jì)算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與待測(cè)多肽長(zhǎng)度相同、分子量相近的多肽繪制個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的多肽濃度計(jì)算值與理論值之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但求得的濃度計(jì)算值相比BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度計(jì)算值更接近理論值(P0.05)。不同方法的精密度之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。應(yīng)用多肽自身繪制個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法評(píng)價(jià)BSA、CYE與1018在羥磷灰石粉末表面的吸附量,結(jié)果表明,在濃度達(dá)到75μg/mL時(shí),CYE與1018的吸附量到達(dá)平臺(tái)期,而BSA有增加趨勢(shì)。結(jié)論當(dāng)多肽含有色氨酸或酪氨酸時(shí)可以使用消光系數(shù)法;當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品在結(jié)構(gòu)、疏水性等方面的性質(zhì)越接近待測(cè)物,使用個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法得到的濃度計(jì)算值越準(zhǔn)確,可用作多肽濃度的快速半定量測(cè)定。應(yīng)用個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法能夠評(píng)價(jià)多肽在羥磷灰石表面的吸附量。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

圖 1 消光系數(shù)法濃度計(jì)算值與濃度理論值比較.2.2 BCA 法與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的 BCA 法根據(jù) BCA 法（標(biāo)準(zhǔn)品：BSA）與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的 BCA 法（標(biāo)準(zhǔn)品：CYE、CLHY）的 4 條標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的 4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方程式，分別計(jì)算出 BSA 與多肽濃度（圖 4）。標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2均大于 0.99，線性關(guān)系良好。4 條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率由大到小依 CHY＞CLP＞CYE＞BSA（P＜0.05），與肉眼所見形成的紫色絡(luò)合物顏色深淺致。將各組濃度計(jì)算值與理論值相比較，如圖 3 所示，在 BCA 法中，使用 BSA 標(biāo)線計(jì)算得到的 CYE、CLP 與 CHY 的濃度計(jì)算值大于理論值，而使用 CYE、C CHY 的個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算 BSA 的濃度值，其計(jì)算結(jié)果均小于理論值（P.05）；使用 CYE 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 CLP 與 CHY 的濃度，二者計(jì)算值均大于理論值（0.05）；使用 CLP 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 CYE 與 CHY 的濃度，CYE 濃度計(jì)算值小于理

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 與 CLP 濃度，二者計(jì)算值均小于理論值（P＜0.05）。述結(jié)果可知，不管是 BCA 法還是個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的 BCA 法，使用 BSA是 CYE、CLP 與 CHY 個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度計(jì)算值與理論值之間均異。比較不同標(biāo)準(zhǔn)曲線下的濃度計(jì)算值與理論值之間的差值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異果表明，個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的 BCA 法的濃度計(jì)算值比 BCA 法的濃度計(jì)算值值（P＜0.05）。

圖 3 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算同一蛋白或多肽的濃度計(jì)算值與理論值的比較2.2.3 BSA、CYE、CLP 與 CHY 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自身濃度分別用 BSA、CYE、CLP 與 CHY 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自身濃度，其標(biāo)準(zhǔn)方程及 R2如表5 所示。計(jì)算結(jié)果表明 BSA、CYE、CLP 以及 CHY 通過自身標(biāo)定計(jì)算的濃度計(jì)算值均與理論值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 4）。R2均大于 0.99，線性良好。表 5 自身個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的 BCA 法標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及 R 平方值Satandard Satandard curve R2BSA y = 0.0003x + 0.1216 0.9961CYE y = 0.0005x + 0.1205 0.9987CLP y = 0.0010x + 0.1105 0.9993CHY y = 0.0013x + 0.1292 0.9978
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